猪源乳酸杆菌与益生元组合筛选及其体外发酵特性

【目的】对3株乳酸杆菌和4种寡糖类益生元进行组合筛选,并探究其对猪结肠微生物体外发酵特性的影响。【方法】将3株乳酸杆菌(罗伊氏乳杆菌L45、植物乳杆菌L47和罗伊氏乳杆菌L63)分别添加至以菊粉(inulin)、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)或乳果糖(lactulose)为唯一碳源的培养基中,结合菌株24 h的生长活性和产酸特性,筛选出最优组合;进一步利用体外发酵技术探究所筛选合生元组合对微生物和发酵特性的影响。【结果】L45和L63分别以FOS和Lactulose为碳源发酵时的生长曲线与葡萄糖相似,L47发酵Inulin和FOS的ΔOD600显著高于葡萄糖(P<0.05),且L47发酵Inulin产生的乳酸是葡萄糖的1.20倍,L47+FOS和L47+Inulin组合效应较好。体外发酵结果表明,与对照组相比,L47+FOS和L47+Inulin降低了发酵液中螺旋体门(Spirochaetes)的相对丰度,提高了乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度;L47+Inulin和L47+FOS显著提高了总短链脂肪酸含量(P<0.05);与L47+Inulin组相比,L47+FOS组乙酸和丁酸含量更高(P<0.05)。【结论】L47+FOS与L47+Inulin具有较好的组合效应,且具有改善猪结肠体外发酵的能力,提示L47+FOS和L47+Inulin作为合生元的发展潜力,两种组合在体内情况的效果有待深入研究。     

多囊卵巢综合征患者与健康人群肠道菌群差异性分析

目的比较多囊卵巢综合征(PCOS)患者与健康人群间肠道菌群的差异,为后续研究提供参考。方法采用16S rDNA扩增子测序法对30例PCOS患者(PCOS组)和20例健康人(健康组)粪便标本中菌群结构进行分析,并比较两组之间的区别。结果与健康组相比,PCOS组患者肠道菌群α多样性降低。PCOS组患者肠道厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)丰度高于健康组,拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度低于健康组(均P0.05)。两组对象肠道梭菌门(Clostridia)、放线菌门(Actinobacteria)丰度差异无统计学意义(均P0.05)。PCOS组患者肠道变形杆菌纲(Proteobacteria)、芽胞杆菌纲(Bacilli)、红椿杆菌纲(Coriobacteriia)丰度高于健康组,拟杆菌纲(Bacteroidia)丰度低于健康组(均P0.05)。PCOS组患者肠道布劳特菌属(Blautia)、霍氏真杆菌属(Eubacterium_hallii_group)、阴沟杆菌属(Agathobacter)丰度高于健康组,拟杆菌属(Bacteroides)、粪杆菌属(Faecalibacterium)丰度低于健康组(均P0.05)。两组对象肠道双歧杆菌属(Bifidobacterium)、埃希菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)丰度差异无统计学意义(均P0.05)。结论 PCOS患者存在肠道菌群失调情况,但其是否是PCOS发展的潜在致病因素需要进一步研究。     

用DREAM技术纠正人工合成基因中的突变

目的：介绍一种简便、有效的定点突变技术。方法：根据突变位点附近的DNA序列推导出氨基酸序列,再以此氨基酸序列进行逆翻译,这样在不改变氨基酸序列的前提下可以得到数目巨大的隐性突变体（silent mutants）,这些突变体中包含大量的限制性内切酶位点,选择合适的酶切位点设计引物用PCR技术扩增两侧DNA片段,然后以相应酶切融合这两个片段即可完成定点突变。结果：用该方法成功地在人工合成的含有缺失的可溶性组织因子基因的472位插入C,T两个碱基,校正了阅读框架,获得了预期的目的基因。结论：该方法简便、有效, 避免了多轮PCR和合成长引物导致突变的可能性,这种改进的PCR 定点诱变技术我们称之为“设计限制酶辅助突变”（Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis, DREAM）。此技术简单方便, 诱变的成功率高, 适于实验室常规应用。     

碳代谢基因gabT调控生防菌Snea253的γ-氨基丁酸代谢途径影响杀线虫活性

【背景】委内瑞拉链霉菌Snea253是本实验室前期获得的具有杀植物线虫活性的生防放线菌,通过生物信息学分析,γ-氨基丁酸转氨酶基因(gabT)是参与Snea253碳代谢的重要基因之一。【目的】明确gabT基因通过调控Snea253的γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)代谢通路,从而影响菌株的活性。【方法】以紫外诱变所得弱毒株(Snea253-R)为材料,以南方根结线虫为靶标,在弱毒株中过表达gabT基因,通过酶联免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)分别检测菌株中GABA和下游代谢产物琥珀酸的含量及杀线虫活性,同时检测在不同碳源培养条件下野生型菌株gabT基因表达水平、产物含量和杀线虫活性。【结果】过表达菌株R-p IB139的gabT基因上调表达,GABA含量降低,琥珀酸含量升高,杀线虫活性提高了39%;在8种不同碳源培养条件下,gabT基因在野生株中相对表达量较高的培养基碳源是可溶性淀粉和玉米淀粉,其发酵液中GABA含量较低,发酵液中下游代谢产物增多,杀线虫活性较高。【结论】通过改变gabT基因的表达,明确GABA支路在调控Snea253代谢以提高杀线虫的过程中发挥重要作用。     

化学交联处理对PSⅡ放氧核心复合物荧光光谱的影响

选用5种交联剂（EDC、DCC、HMDI、EGS和DTSP）,在不同浓度条件下交联处理PSⅡ放氧核心复合物,测定了交联样品的室温荧光发射光谱和荧光激发光谱。结果表明：交联处理对PSⅡ放氧核心复合物叶绿素荧光和蛋白内源荧光都有影响,引起682nm处叶绿素荧光强度的降低、308nm或328nm处蛋白质内源荧光强度的增大或减小,并与处理时所用交联剂的浓度、交联剂的亲疏水性和交联臂长相关。亲水性EDC对PSⅡ的蛋白质中Tyr和Trp残基所处循环境的影响较小;而亲脂性DCC、HMDI、EGS、DTSP对PSⅡ放氧核心复合物蛋白质中Tyr、Trp微环境和682nm处叶绿素荧光影响大,可能它们参与了PSⅡ放氧核心复合物内部的蛋白疏水区域交联。     

一种简便、高效、经济的从凝胶中回收DNA的方法

目的:尝试一种简便、高效的从凝胶中回收DNA的方法。方法:在Eppendorf管的管底用注射器扎孔,将一小团用Eppendorf管融化后拉成的细丝放入管中,把含有DNA的凝胶放在细丝上,离心,收集从管底流出的液体,经酚氯仿抽提后用乙醇沉淀DNA。结果:经过简单的离心即可近乎100%地回收凝胶中的DNA。结论:使用该方法从琼脂糖凝胶回收DNA,操作简单,回收率高,无其他试剂污染。     

用于植物光系统Ⅱ蛋白酶检测的活性染色方法

采用分离胶中加入0.25%明胶作为底物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对光系统Ⅱ颗粒及其1 mol/L NaCl抽提液中存在的蛋白酶进行了分离、活性检测和部分性质分析.在PSⅡ颗粒的1 mol/L NaCl抽提液中检测到有6条酶带存在,分子质量分别为34、37、50、54、58和68 ku.初步分析了还原剂、离子强度等对蛋白酶活性的影响.此方法分离与检测同步,具有灵敏度高、方便等优点.     

马桑内酯对培养的大鼠大脑皮层神经元γ─氨基丁酸、生长抑素分泌的影响

本文利用培养的大鼠大脑皮层神经元,在不同浓度马桑内酯（５μｍｏｌ／Ｌ～２５０μｍｏｌ／Ｌ）作用后１２、２４、４８小时,应用双抗夹心法检测各时间点培养上清中γ－氨基丁酸和生长抑素含量。结果表明,各浓度中以２５μｍｏｌ／Ｌ马桑内酯作用最明显,在此浓度作用后１２小时,γ－氨基丁酸分泌受抑（抑制率为８．３％）,生长抑素分泌则增加（增加率为２０．４％）。作用后２４、４８小时,γ－氨基丁酸分泌进一步受抑（抑制率为１０．６％、１４．５％）,而生长抑素分泌则呈现增加幅度降低趋势（增加率为１１．７％、８．２％）。与未加药组相比,γ－氨基丁酸在三个时间点均有统计学意义（Ｐ＜０．０５）,而生长抑素只在加药后１２小时有统计学意义（Ｐ＜０．０５）、本文对马桑内酯作用后两种神经递质变化的意义进行了讨论。     

用于光系统Ⅱ制剂蛋白亚基位置分析的化学交联法

采用双功能化学交联剂处理PSⅡ放氧核心复合物,借助SDS-PAGE分析交联产物,可以判断蛋白组分的相对空间位置,实验结果表明交联反应与交联剂种类,性质,浓度和反应温度相关,此法适于含多亚基膜蛋白复合体相对空间位置的分析。     

低蛋白质日粮对断奶仔猪生长相关激素和肠道微生物区系的影响

【目的】在饲喂低蛋白质日粮条件下,探究断奶仔猪生长相关激素、回肠和盲肠微生物组成及其代谢产物的变化。【方法】选取体重相近杜长大断奶仔猪54头,随机平均分为3组,每组18头,分别饲喂含20%(NP组)、17%(MP组)和14%(LP组)粗蛋白日粮,平衡日粮中的赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸,于试验第10、25和45天每组屠宰6头,采血测定血常规和生长相关激素;于第45天采集回肠和盲肠食糜,分析微生物及其代谢产物。【结果】与NP组相比,第25和45天时MP和LP组尿素氮水平显著降低(P0.05),第25天时LP组甘油三脂含量、第45天时LP组胆固醇含量显著增加(P0.05)。各时间点血液胰高血糖素、胰岛素、生长激素、T3和T4在3组之间差异均不显著。门水平上,回肠和盲肠中的微生物均以厚壁菌门占主导地位,但各组间差异不显著;随日粮蛋白质含量降低,乳酸杆菌属呈上升趋势,严格梭菌属呈下降趋势,但差异不显著。降低日粮蛋白质含量显著减少了回肠和盲肠中氨氮的产量(P0.05)。【结论】断奶仔猪日粮蛋白质降低3或6个百分点不影响机体生长相关激素的分泌,但能降低血液尿素氮和肠道内氨氮的浓度,对肠道有益菌乳酸杆菌属的相对丰度有一定的提高作用。这说明低蛋白质日粮能提高断奶仔猪对饲料氮源的利用率,且有利于肠道健康。