中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128自体诱导物合成酶基因的克隆及对生理功能的影响

[目的]从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆自体诱导物合成酶基因,从而研究该基因在Sinorhizobium sp.1128群体感应系统中的作用.[方法]利用基因序列同源性比对以及分子克隆的方法,从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128中克隆自体诱导物合成酶基因;利用大肠杆菌异源表达、C18反相薄层层析(TLC)的方法研究该基因的特性;通过中间片段融合的方法缺失该基因,并通过结瘤实验研究该基因对Sinorhizobium sp.1128生理功能的影响.[结果]以草木樨中华根瘤菌Sinorhizobium medicae WSM419自体诱导物合成酶基因Smed_1560序列设计引物,通过PCR扩增在Sinorhizobium sp.1128中寻找到一新的自体诱导物合成基因,命名为traI2.该基因在大肠杆菌Escherichia coli DH5α中表达后能产生两种自体诱导物分子.在Sinorhizobium sp.1128中将该基因缺失,自体诱导物活性下降;回复突变后,自体诱导物活性得到恢复,结瘤实验结果表明该基因能影响根瘤菌的结瘤效率.[结论]中华根瘤菌Sinorhizobium sp.1128群体感应系统是一个复杂的交互系统,它对结瘤的生理功能具有一定的影响.     

人参皂苷Rh_4对小鼠移植性肿瘤的抑制作用

本文阐述了三七中人参皂苷Rh4的体内抗肿瘤作用。建立S180肉瘤和肝癌H22荷瘤小鼠动物模型,将接种后的小鼠随机分为阴性对照组、阳性对照组及人参皂苷Rh4高、中、低剂量组,采用腹腔给药和灌胃给药两种方式,观察人参皂苷Rh4对小鼠移植性肿瘤的体内抑制作用以及对动物免疫器官重量的影响。结果表明:采用腹腔注射给药和灌胃给药,人参皂苷Rh4各剂量组对S180肉瘤小鼠和肝癌H22小鼠肿瘤生长均有抑制作用。与阴性对照组比较,当人参皂苷Rh4剂量为4.5 mg/kg灌胃给药时,对肉瘤S180的抑制率为47.84%(P0.01);当Rh4剂量为10.0 mg/kg腹腔注射给药时,对肝癌H22的抑制率为52.72%(P0.01)。人参皂苷Rh4对荷瘤小鼠免疫器官未见明显影响。     

三七转录因子PnWRKY1对三七皂苷生物合成的影响

该研究以野生型三七为材料,采用同源克隆的方法,获得三七转录因子PnWRKY1基因,运用农杆菌转化法构建转基因细胞系,通过测定转基因细胞系中的总皂苷含量以及重要单体皂苷的含量,并采用qRT-PCR分析皂苷合成途径中相关基因的表达情况,为三七皂苷生物合成高效调控策略的建立提供理论依据。结果显示:(1)转录因子PnWRKY1长度为810bp,编码269个氨基酸。(2)成功构建PnWRKY1过表达载体pCAMBIA2300sPnWRKY1,经农杆菌转化获得了6株具有卡那霉素抗性的转基因细胞系(T_1~T_6),对卡那霉素基因nptⅡ进行PCR检测表明,所有细胞系均有与预期大小一致的450bp特异性条带,说明成功获得了6株PnWRKY1过表达转基因细胞系。(3)6株转基因细胞系中的PnWRKY1表达水平均极显著高于野生型细胞系,其中表达量最高的T_3细胞系比野生型增加了5.36倍。(4)过表达PnWRKY1基因细胞系的总皂苷生物合成均得到显著提高,其中T_1~T_6中总皂苷含量分别为野生型细胞系的2.46、1.98、2.67、1.74、2.54和1.98倍;6株过表达PnWRKY1细胞系中的4种单体皂苷R1、Rg1、Re、Rb1的含量与野生型细胞系相比均有不同程度的提高,且T_3细胞系中的单体皂苷Re含量最高(37.81mg/g)。(5)与野生型细胞系(WT)相比,过表达PnWRKY1细胞系中三七皂苷合成途径中的关键酶基因PnDS、PnSS和PnSE的最高表达水平分别增加3.1、4.0和4.5倍。研究表明,转录因子PnWRKY1在三七细胞中的过表达可能参与调节皂苷生物合成部分重要酶基因的表达,且PnWRKY1可能通过调控三七皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达间接影响三七皂苷的合成。     

RNAi介导珠子参PjCAS基因沉默对皂苷合成的影响

该研究利用Gateway技术构建珠子参环阿屯醇合成酶基因(Panax japonicus cycloartenol synthase,PjCAS)的RNAi表达载体,利用农杆菌介导转化在珠子参细胞中成功实现了PjCAS 的RNA干扰;采用实时荧光定量PCR分析珠子参皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达情况,同时检测转基因细胞中皂苷和植物甾醇含量的变化,探讨PjCAS基因对珠子参皂苷合成的调控作用。结果表明：(1)成功获得PjCAS基因的RNAi片段,并成功构建了PjCAS基因RNAi载体pHellsgate PjCAS。(2)经农杆菌遗传转化,获得6株实现PjCAS基因RNA干扰的转基因阳性细胞系。(3)与普通细胞系相比,转基因细胞系中PjCAS基因的表达量大约下降了85%,同时与珠子参皂苷合成直接相关的关键酶基因PjDS、PjAS表达量最高分别上调了90%和150%。(4)转基因细胞系中6种单体皂苷的含量均显著高于对照组,其中达玛烷型单体皂苷Re、Rb1、Rd和齐墩果烷型单体皂苷R0、IV、IVa的平均含量比普通珠子参细胞系分别提高了28%、49%、40%、36%、59%、50%。说明珠子参皂苷含量的变化受PjCAS基因的间接调控。(5)6株转基因细胞系中植物甾醇含量较对照显著降低了53%~73%。研究发现,沉默PjCAS基因可促进珠子参皂苷合成的关键酶基因PjDS、PjAS显著上调表达,并提高转PjCAS基因细胞系中单体皂苷的含量,从而促进了珠子参皂苷合成量的显著增加,证明通过抑制植物甾醇合成通路关键基因PjCAS的表达可以有效降低植物甾醇合成支路的代谢通量,使更多的代谢流朝着珠子参皂苷合成方向流动,最终促进了珠子参皂苷的生物合成。