贵州省两栖动物新纪录——宜章臭蛙及其系统发育分析

2015年5月至7月在贵州省梵净山国家级自然保护区采集到6号臭蛙标本,经鉴定为宜章臭蛙(Odorrana yizhangensis)(两栖纲,无尾目,蛙科),属贵州省两栖动物新纪录。本文给出了这6号标本的22项外形特征量度,并描述了其生境特征。基于12S r RNA和16S r RNA基因片段构建的最大似然系统发育树表明,这些标本与宜章臭蛙模式产地标本聚在一起,且他们之间的遗传距离远远小于臭蛙属物种之间的距离。宜章臭蛙在贵州的新记录将促进该物种的分类与谱系地理学研究。     

珠子参中HMGR基因对皂苷生物合成的影响

该研究以珠子参愈伤组织为材料,通过同源克隆方法获得了珠子参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因(PjHMGR,登录号:MG712296)的cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。基于PjHMGR序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjHMGR,通过根瘤农杆菌转化法将其转化到珠子参细胞中,成功获得7株阳性转PjHMGR基因细胞系;通过实时荧光定量PCR、比色法及皂化法等技术测定阳性细胞系PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活、皂苷和植物甾醇含量变化。结果显示:(1)与野生型珠子参细胞系相比,转PjHMGR基因珠子参阳性细胞系中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量均有不同程度的提高;在效果最好的阳性细胞中,PjHMGR基因的相对表达量、HMGR酶活和皂苷含量分别为对照的7.15、6.14和3.50倍。(2)在研究过程中,发现转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高。研究认为,将珠子参关键酶基因PjHMGR过表达载体导入珠子参愈伤组织细胞中,可引起相关关键酶基因相对表达量和PjHMGR酶活性的增加,从而调控珠子参总皂苷的合成,对皂苷合成途径中关键酶基因进行调控将可能实现对皂苷生物合成的调节。     

珠子参中法尼基焦磷酸合酶(FPS)对皂苷生物合成的影响研究

珠子参作为名贵中草药已有上千年应用历史,珠子参皂苷是珠子参的主要活性成分,由达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷组成。目前,对珠子参皂苷的生物合成了解甚少,有必要开展与皂苷合成相关的基础研究工作。已有报道表明,法尼基焦磷酸合酶（FPS）可能是植物中皂苷合成的关键酶。本研究克隆了珠子参FPS基因（PjFPS）的cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。基于PjFPS序列构建了珠子参过表达载体pCAMBIA2300s-PjFPS,将其转化到珠子参细胞中,成功获得阳性转基因细胞;测定了阳性细胞系中PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷以及植物甾醇含量的变化。结果表明,与野生型珠子参细胞相比,PjFPS转基因珠子参细胞系中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活以及皂苷含量均有不同程度的提高。而且,由于皂苷合成代谢流的增加,也促进了相关重要关键酶基因的表达。在效果最好的阳性细胞中,PjFPS基因的相对表达量、FPS酶活、皂苷含量分别为对照的12、4和3倍;同时,转基因细胞系的植物甾醇含量也有所升高。本研究通过对皂苷合成途径关键酶基因的调控实现了对皂苷生物合成的调节,为获得高效、稳定的珠子参皂苷合成调控技术提供理论参考和依据。     

三七转录因子PnWRKY1对三七皂苷生物合成的影响

该研究以野生型三七为材料,采用同源克隆的方法,获得三七转录因子PnWRKY1基因,运用农杆菌转化法构建转基因细胞系,通过测定转基因细胞系中的总皂苷含量以及重要单体皂苷的含量,并采用qRT-PCR分析皂苷合成途径中相关基因的表达情况,为三七皂苷生物合成高效调控策略的建立提供理论依据。结果显示:(1)转录因子PnWRKY1长度为810bp,编码269个氨基酸。(2)成功构建PnWRKY1过表达载体pCAMBIA2300sPnWRKY1,经农杆菌转化获得了6株具有卡那霉素抗性的转基因细胞系(T_1~T_6),对卡那霉素基因nptⅡ进行PCR检测表明,所有细胞系均有与预期大小一致的450bp特异性条带,说明成功获得了6株PnWRKY1过表达转基因细胞系。(3)6株转基因细胞系中的PnWRKY1表达水平均极显著高于野生型细胞系,其中表达量最高的T_3细胞系比野生型增加了5.36倍。(4)过表达PnWRKY1基因细胞系的总皂苷生物合成均得到显著提高,其中T_1~T_6中总皂苷含量分别为野生型细胞系的2.46、1.98、2.67、1.74、2.54和1.98倍;6株过表达PnWRKY1细胞系中的4种单体皂苷R1、Rg1、Re、Rb1的含量与野生型细胞系相比均有不同程度的提高,且T_3细胞系中的单体皂苷Re含量最高(37.81mg/g)。(5)与野生型细胞系(WT)相比,过表达PnWRKY1细胞系中三七皂苷合成途径中的关键酶基因PnDS、PnSS和PnSE的最高表达水平分别增加3.1、4.0和4.5倍。研究表明,转录因子PnWRKY1在三七细胞中的过表达可能参与调节皂苷生物合成部分重要酶基因的表达,且PnWRKY1可能通过调控三七皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达间接影响三七皂苷的合成。     

RNAi介导珠子参PjCAS基因沉默对皂苷合成的影响

该研究利用Gateway技术构建珠子参环阿屯醇合成酶基因(Panax japonicus cycloartenol synthase,PjCAS)的RNAi表达载体,利用农杆菌介导转化在珠子参细胞中成功实现了PjCAS 的RNA干扰;采用实时荧光定量PCR分析珠子参皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达情况,同时检测转基因细胞中皂苷和植物甾醇含量的变化,探讨PjCAS基因对珠子参皂苷合成的调控作用。结果表明：(1)成功获得PjCAS基因的RNAi片段,并成功构建了PjCAS基因RNAi载体pHellsgate PjCAS。(2)经农杆菌遗传转化,获得6株实现PjCAS基因RNA干扰的转基因阳性细胞系。(3)与普通细胞系相比,转基因细胞系中PjCAS基因的表达量大约下降了85%,同时与珠子参皂苷合成直接相关的关键酶基因PjDS、PjAS表达量最高分别上调了90%和150%。(4)转基因细胞系中6种单体皂苷的含量均显著高于对照组,其中达玛烷型单体皂苷Re、Rb1、Rd和齐墩果烷型单体皂苷R0、IV、IVa的平均含量比普通珠子参细胞系分别提高了28%、49%、40%、36%、59%、50%。说明珠子参皂苷含量的变化受PjCAS基因的间接调控。(5)6株转基因细胞系中植物甾醇含量较对照显著降低了53%~73%。研究发现,沉默PjCAS基因可促进珠子参皂苷合成的关键酶基因PjDS、PjAS显著上调表达,并提高转PjCAS基因细胞系中单体皂苷的含量,从而促进了珠子参皂苷合成量的显著增加,证明通过抑制植物甾醇合成通路关键基因PjCAS的表达可以有效降低植物甾醇合成支路的代谢通量,使更多的代谢流朝着珠子参皂苷合成方向流动,最终促进了珠子参皂苷的生物合成。