双酶偶联转化富马酸制备β-丙氨酸的工艺的建立与优化

酶转化法是生产β-丙氨酸的重要途径,但单一酶法转化存在底物价格较高的问题。通过构建双酶催化体系制备β-丙氨酸,即将来源于大肠杆菌的天冬氨酸酶(AspA)和来源于谷氨酸棒杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶(PanD)偶联,以富马酸和氨为底物进行酶促反应合成β-丙氨酸。催化反应中AspA与PanD的最适加酶比例为1∶80,其中AspA的浓度为10μg/mL,转化温度为37℃,pH为7.0;浓度为100 mmol/L的富马酸可在8 h内被完全转化,转化率为100%,摩尔产率为90.9%,β-丙氨酸的产量为90 mmol/L,约为7 g/L;浓度为200 mmol/L的富马酸在反应8 h后,体系中β-丙氨酸的产量为126 mmol/L,约合9.8 g/L,继续延长反应时间,转化率并没有明显提高。根据该研究提出的双酶偶联转化工艺可将价格低廉的富马酸一步转化为具有高附加值的β-丙氨酸。     

高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G上游的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno sequence,SD)替换成翻译起始强度更高的异源SD,同时优化各亚基之间间隔序列的长度,并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过E.coli重组表达系统过表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase进行纯化,并通过凝胶过滤层析确定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件,并建立底物恒速流加的细胞催化工艺,模拟了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase在E.coli中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性为85.5±4.3 U/mg,纯酶比活为234.0±11.7 U/mg,H-NHase相对分子质量为504.5±9.8 k D。细胞催化最适p H为7.5,最适温度为25°C,底物浓度为400 mmol/L。在此条件下,重组菌细胞酶活为256.0±10.4 U/m L,流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase大肠杆菌细胞生长迅速,发酵周期短,应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率,具有潜在的工业价值。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C的异源表达和应用

旨在研究大肠杆菌产磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)的发酵表达和分离纯化,探究PI-PLC酶切GPI锚定蛋白的效果。依据NCBI数据库中蜡样芽孢杆菌的PI-PLC的基因序列,按照大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化,合成相应基因序列并构建基因表达载体pGEX-6P-1-PI-PLC。将重组质粒转入受体菌E.coli BL21(DE3)中,通过加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因PI-PLC表达。经检测,含有GST标签的PI-PLC融合蛋白以可溶蛋白形式存在于菌体破碎上清,分子量约为61 kDa,与预期相符。初步优化诱导表达条件后,发现最佳诱导表达条件为:以接种量5%接种体积分数接种,待菌体生长至OD600nm达到0.5,在16℃条件下以0.3 mmol/L浓度IPTG诱导24 h。利用GST标签对蛋白进行纯化,纯化后的PI-PLC质量浓度为0.52 mg/mL,比酶活为1322.5 U/mg。利用PI-PLC酶液对哺乳动物细胞表面的模式GPI锚定蛋白CD59进行酶切,酶切作用显著。因此,下一步可以将PI-PLC融合蛋白应用于细胞生物学中对GPI-APs的研究和鉴定。     

温度调节基因开关调控大肠杆菌发酵合成L-丙氨

【目的】L-丙氨酸的存在导致Escherichia coli的生长速率显著降低,最终会降低发酵过程中L-丙氨酸的体积合成速率。用温度调节基因开关(λpR-pL)高效、动态调控重组E. coli菌株菌体生长与L-丙氨酸合成过程,使两者相协调。【方法】以野生型E. coli B0016为出发菌株,敲除乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸代谢产物合成途径以及丙氨酸消旋酶编码基因(ackA-pta、pflB、adhE、frdA、ldhA、dadX),获得菌株B0016-060B。将嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源的L-丙氨酸脱氢酶基因(alaD)克隆于pL启动子下游,并在B0016-060B菌株中表达,获得菌株B0016-060B/pPL-alaD,进行摇瓶和发酵罐发酵考察菌体生长和L-丙氨酸发酵性能。【结果】竞争代谢途径的敲除显著降低了副产物合成量,仅形成极少量的乙酸、琥珀酸和乙醇。28 °C下菌株B0016-060B/pPL-alaD几乎不合成L-丙氨酸,可保证菌体快速生长;而在42 °C下可高效合成L-丙氨酸。经发酵罐发酵,可合成67.2 g/L L-丙氨酸,体积生产强度达到2.06 g/(L·h)。【结论】通过发酵培养温度的简单切换,分阶段实现了细胞的快速增量和L-丙氨酸的高强度合成。     

茶碱激活型RNA分子开关的构建及在枯草芽胞杆菌中调节外源基因表达的性能

枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis在工业生物技术以及合成生物学领域作为一种重要的微生物可广泛用作代谢工程、重组蛋白表达以及新型基因电路的底盘。在B. subtilis中构建基于非编码RNA的高精准调节元件,能够实现不依赖蛋白质因子的基因表达调控,丰富B.subtilis基因表达通用工具。通过基因工程手段,设计了基于茶碱适体域的核糖开关E和适体核酶AZ调节元件,并与不同的B.subtilis内源组成型启动子适配,构建出茶碱激活型基因表达控制元件。测定这两种调节元件与6种组成型启动子组合匹配下报告基因GFP的荧光强度,鉴定并分析各调控元件的工作性能。并进一步以红色荧光蛋白mCherry和普鲁兰酶两种不同的异源蛋白验证核糖开关或适体核酶与启动子的最优组合。结果表明,同一种RNA调节元件与不同启动子组合呈现不同水平的调控效率。在核糖开关与启动子的组合中,启动子PsigW和核糖开关E组合(sigWE)对GFP表达的诱导率最高,达到16.8。在适体核酶与启动子的组合中,AZ与启动子P43、PrpoB组合(P43AZ和rpoBAZ)的诱导率最高,分别达到了6.1和6.2。进一步验证结果显示,sigWE调控mCherry的诱导率最高(9.2),而P43E调控普鲁兰酶的诱导率最高(32.8),产酶水平达到了81U/mL。核糖开关和适体核酶对GFP、mCherry、普鲁兰酶均能实现调控,但是不同元件组合的调控性能有所差异,对不同基因的调控效果也不尽相同。     

Rhodococcus rhodochrous J1腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略

针对红球菌低分子量腈水合酶（L—NHase）在重组茵中难以表达这一问题,通过对其d亚基及调控蛋白NhlE基因的核糖体结合位点和0c,口亚基间隔序列的长度进行改造,构建了重组表达载体,实现了L．NHase及其调控蛋白NhlE在E．coliB121（DE3）中过量表达。通过培养条件优化,得到最佳表达条件为：37℃培养茵体浓度（DD600）到1．0时,加入终浓度为0．1g／L的CoCl2·6H,0,0．6mmol／L的IPTG,然后在24℃下诱导表达24h。最终得到的重组蛋白粗酶液的活性为（109．9-I-5．5）U／rag。采用Strep．tag／Strep—Tactin亲和层析简化了L-NHase的纯化方法,本研究结果为一些难于异源重组表达的多亚基蛋白质的表达具有一定的借鉴意义。     

基因串联策略强化枯草芽孢杆菌终止子的功能及其在基因表达中的应用

在底盘微生物中使用高性能终止子能够显著增强基因终止效率,维持新合成mRNA的稳定性,提升外源基因表达性能。而目前缺乏专一用于枯草芽孢杆菌的终止子元件,限制了复杂功能基因电路的设计。[目的] 在枯草芽孢杆菌中挖掘新的高性能终止子,并进一步重新设计,丰富适用于这一底盘的高性能人工终止子。[方法] 将枯草芽孢杆菌终止子和枯草芽孢杆菌噬菌体终止子分别构建至终止子检测质粒中,测定各终止子的终止效率（terminator efficiency,TE）。将不同强度单终止子按强弱、强强、弱弱组合构建串联终止子,测定不同组合体的终止性能。利用高性能串联终止子进行天冬氨酸氨基裂解酶（AspA）和β-葡萄糖苷酸酶（GusA）的表达功能验证,检测高性能终止子对基因表达水平的作用。[结果] 经过检测,TB5终止子终止效率最强,TE为98%。含有TB5终止子的表达体系中GFP水平比对照上调2.2倍,RFP的表达水平下调27倍。双串联组合体终止子中,TH1.5b-TB5（TE=97%）和TB5-TB5（TE=98%）串联终止子可将RFP的表达水平下调30倍。而三串联终止子中,TB2-TB5-TB5组合体与相应的双组合体相比,GFP的表达水平虽无进一步提升,但RFP的表达仅有参照的1/300。最后,通过AspA和GusA的重组表达确证了串联终止子TH1.5b-TB5和TB10-TB5对基因表达水平的提升作用。[结论] 高终止效率的终止子可以显著提升上游基因的表达水平,通过一定规律的基因串联能够进一步提升终止子的工作效率。这种人工再设计的终止子可方便、快捷地构建至细菌基因表达系统,实现基因表达的高效调控。     

融合双亲短肽提高腈水合酶的热稳定性研究

腈水合酶(Nitirle hydratase, NHase)催化腈类物质转化为酰胺类物质,目前用于工业生产丙烯酰胺。但在催化过程中释放的热量易导致酶分子失活。研究通过蛋白质融合技术对腈水合酶进行分子改造,提高热稳定性。将2种双亲自组装肽（self-assembling peptides, SAPs）EAK16和ELK16分别融合至恶臭假单胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668来源NHase非催化亚基β的N末端,构建出2种融合型NHase：EAK16-NHase和ELK16-NHase。经过表达、纯化后测定酶活力,发现EAK16-NHase和ELK16 NHase的酶活力分别为(426±14) U/mg和(372±12) U/mg,保留野生型酶活力的97%和85%。在50 ℃条件下孵育0~60 min,每5 min取样后测定残存酶活力,EAK16-NHase和ELK16-NHase酶活力半衰期（T₅₀）分别为35 min和40 min,野生型NHase为20 min。说明融合EAK16和ELK16均能提高NHase的热稳定性。研究表明融合SAPs能在不显著影响酶活力的条件下提高酶的热稳定性。     

紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究

来源于紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的苯丙氨酸羟化酶结构简单,性质更接近于人的苯丙氨酸羟化酶,具有潜在的医药应用价值。从紫色色杆菌基因组中克隆得到苯丙氨酸羟化酶基因pah。构建重组表达载体pET24a-pah,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现高效表达。离子层析纯化后,重组蛋白比酶活高达503.2 U/mg。酶学性质研究显示,该重组酶的最适温度为40℃左右,50℃时PAH的半衰期为15 min;最适pH在7.5左右,在pH6-8范围内较稳定。37℃,pH7.5条件下,Km值为1.5 mmol/L,Vmax为0.5 mmol/min,kcat为5.05/s,催化效率kcat/Km为3.37 L/mmol·s。     

杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块，可以通过天冬氨酸α脱羧酶（Pan D）催化L-天冬氨酸脱羧来合成，但普遍在用的Pan D酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈。因此，本研究通过酶的挖掘，选择将杰氏棒杆菌来源（Corynebacterium jeikeium）Pan D在Escherichia coli中异源表达。对杰氏棒杆菌来源Pan D进行Alaph Fold2建模和分子对接，采用Rosetta虚拟突变确定突变热点，结合薄层层析初筛和纯化后复筛，最终筛选到突变体L39A，其比酶活为13.45 U/mg，相比野生型酶的比酶活（9.6 U/mg）提升了1.4倍。酶学性质表征数据表明，野生型酶和L39A突变体最适p H均为6.5，且在p H 6.0-7.0之间酶活性稳定；两者最适温度为55℃，但L39A热稳定性较野生型提高；突变体酶的催化效率比野生型提升了1.4倍。对突变体进行结构解析发现，39位取代为侧链基团更小的丙氨酸，亲水性增强，增加了关键催化氨基酸58位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用，使活性中心周围的区域稳定性提高，从而提高了催化活性。全细胞催化数据表明，在OD600=4...