嗜酸乳杆菌NCFM粘附宿主后对其粘附相关基因表达的影响

摘要：【目的】益生菌粘附于肠道上皮细胞上是它的一种益生作用。本研究通过体内外实验,分析嗜酸乳杆菌NCFM对粘附相关基因的影响。【方法】利用GO (Gene Ontolog) 分类筛选Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因表达谱芯片中的粘附相关基因,通过体外Caco-2细胞培养模型和体内小鼠粘附模型,采用Real-time PCR方法对粘附相关基因进行验证分析。【结果】经NCFM作用后,12个粘附相关基因呈上调表达。利用Real-time PCR验证,12个基因在体内和体外经嗜酸乳杆菌NCFM作用后亦均同样为上调表达,其中CCL2基因上调表达最为明显。【结论】经体内外研究表明,嗜酸乳杆菌NCFM粘附肠上皮细胞后能够引起宿主粘附相关基因出现特定表达变化,为今后深入揭示其粘附作用提供必要基础。     

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明：ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。     

金黄色葡萄球菌基因表达的DNA扣除法

[目的]金黄色葡萄球菌作为一种分布广泛的致病微生物和研究革兰氏阳性菌遗传背景的模式菌株,利用real-time RT PCR对相关毒素及调控基因进行表达定量分析,在生物、医学、食品检测等领域具有较大研究价值.[方法]对制备好的反转录(RT,含有cDNA和DNA)和非反转录(RTˉ,仅含DNA)样品进行Real-time PCR检测,根据经典(1 E)ˉ△△Ct相对定量算法并结合PCR效率公式建立一种基因表达相对定量分析的DNA扣除法,将得到的Ct值转换为各样品含量,从RT样品中扣除RTˉ样品的量,无需DNaseⅠ酶解处理就可以去除DNA的影响,RTˉ样品的检测结果还可同时作为稳定的DNA内参.[结果]采用以上方法分析金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(sea)、16S rRNA和RNA Ⅲ的表达情况,在含有葡萄糖的NB培养基中sea的相对转录水平随着葡萄糖浓度的增大而升高,RNAⅢ的相对转录水平随葡萄糖浓度的变化而产生小幅度的波动,16S rRNA在菌体生长初期时的表达量较为稳定;与绝对定量法比较,结果差异较小(均小于15%),且差异不显著(p＞0.05).[结论]这种基于DNA扣除法的Real-time RT PCR相对定量方法可以有效的对金黄色葡萄球菌的基因表达进行分析.     

重组β酪蛋白磷酸肽二聚体基因的构建、表达及其生物活性分析

生物活性短肽 β酪蛋白磷酸肽 (β CPP)能够增加细胞对二价离子的吸收、促进受精过程并对细胞增殖产生影响 .为深入研究其生物学功能 ,采用基因工程方法得到β CPP的二聚体基因并构建真核表达载体 ,转染CHO细胞建立稳定表达细胞系 .鉴定纯化所表达产物 ,考察表达产物对精子细胞内游离Ca2 + 水平、细胞增殖和细胞凋亡等方面的影响 .结果表明 ,重组 β CPP二聚体能够显著增加精子细胞对Ca2 + 的吸收、促进脾细胞的增殖并诱导某些肿瘤细胞的凋亡 ,有着广泛的生物学活性和潜在的药理学意义     

应用于乳酸菌的非抗生素抗性选择标记系统

 乳酸菌是一类重要的安全型微生物,在免疫载体疫苗开发及食品菌株改良等医疗、食品领域均有广泛的应用.非抗生素抗性选择标记是乳酸菌基因工程菌株构建中必不可少的关键组成部分,也是目前乳酸菌研究的前沿和热点.根据筛选时质粒和受体菌之间的表型关系及特征,主要分为显性选择标记、互补型选择标记、显性/互补型选择标记、双质粒选择标记4大类.其中显性选择标记中的细菌素抗性/免疫性选择标记及互补型选择标记中的糖类选择标记均有较大的发展潜力及应用空间;双质粒选择标记系统构建的筛选过程新颖独特,为整个选择标记系统的发展开辟了新的途径及思路.     

环介导等温扩增技术快速检测肉中沙门氏菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立了一种快速、高效、灵敏的肉中沙门氏菌的检测方法。针对沙门氏菌的属特异性基因invA设计2对引物,对人工污染肉样以及实际肉样分别进行检测。结果表明：所建立的LAMP反应能够特异性的检测沙门氏菌,对沙门氏菌纯菌的检测灵敏度为普通PCR的100倍,可达到9.8×100CFU/mL。LAMP检测人工污染沙门氏菌肉样的检测限为9.8×101CFU/mL。因此,本实验利用LAMP建立的沙门氏菌检测方法具有快速、灵敏、特异、操作简便的特点,具有广泛发展前景。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中单增李斯特菌

通过建立的环介导恒温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）方法以达到肉中单增李斯特菌快速、灵敏的检出。以特异性的hlyA毒力基因作为靶基因,与6株非单增李斯特菌进行特异性试验,同时对不同培养浓度的单增李斯特菌进行了LAMP和PCR方法的灵敏度比较,进而应用LAMP法检测人工污染肉中的单增李斯特菌。结果表明：纯培养物中单增李斯特菌LAMP检出限为8.8×100CFU/mL,其灵敏度比普通PCR高100倍;在人工污染肉中单增李斯特菌的检出限为8.8×101CFU/mL,在1h内即可完成扩增反应。LAMP方法具备快速、特异、简单、灵敏度高等优势,在食品基质中单增李斯特菌的检测方面具有较好的应用前景。     

嗜酸乳杆菌NCFM对Caco-2细胞基因表达谱的影响

摘要：【目的】嗜酸乳杆菌NCFM作为一株具有良好益生功能的模式菌株,采用基因芯片技术对其作用后的宿主细胞基因的变化情况进行分析,在生物、食品等领域具有较大研究价值。【方法】将嗜酸乳杆菌NCFM和Caco-2细胞共同培养2h,提取Caco-2细胞的总RNA,并将RNA反转录成cDNA,与Human Genome U133 Plus 2.0 Array基因表达谱芯片杂交,杂交后进行图像扫描和数据分析,并采用Real-time RT PCR方法对差异表达的基因进行验证。【结果】采用基因芯片方法检测了Caco-2细胞经嗜酸乳杆菌NCFM作用2h后的基因表达变化,发现差异表达基因为508个,其中有473个基因上调,35个基因下调,初步推测Caco-2细胞能诱导多个基因的表达,以发挥嗜酸乳杆菌NCFM的益生功能。并且经Real-time RT PCR验证,表达差异显著的3个免疫调节相关基因CCL2、PTX3和TNFRSF9的确在嗜酸乳杆菌NCFM作用期间高表达。【结论】以上这些结果促进了对嗜酸乳杆菌NCFM益生功能的认识,也为揭示该乳酸菌的作用机理提供了理论基础。     

嗜酸乳杆菌NCFM对Caco-2细胞中PTX3基因表达的影响

【目的】研究嗜酸乳杆菌NCFM对肠道上皮细胞中免疫与炎症介质因子PTX3表达的影响,并进一步揭示其调节机制。【方法】嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养0、2、4、8和12 h,提取细胞RNA,采用RealTime RT-PCR方法检测PTX3基因的表达。嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养0、0.5、1、2和4 h,提取细胞蛋白质,采用Western blot方法检测NF-κB的磷酸化水平;用NF-κB的特异性抑制剂PDTC预处理Caco-2细胞30 min,然后加入嗜酸乳杆菌NCFM作用2 h,提取细胞RNA,采用Real Time RT-PCR方法检测PTX3基因的表达。【结果】嗜酸乳杆菌NCFM与Caco-2细胞共培养后能诱导PTX3的表达,并且在共培养4 h的时候PTX3的表达量达到最大,然后逐渐下降;嗜酸乳杆菌NCFM能快速的诱导NF-κB的磷酸化,并且在加入其特异性抑制剂PDTC后,PTX3的表达显著下降。【结论】嗜酸乳杆菌NCFM作用于肠道上皮细胞后能够通过迅速激活NF-κB途径暂时性的调控PTX3的表达。     

阪崎克罗诺杆菌的ITS序列分析

摘 要：以分离自不同来源（不同地区乳制品及某一企业婴儿配方乳粉加工生产环境）、经API20E鉴定为阪崎克罗诺杆菌的37株分离株为研究对象,采用ITS序列对其进行鉴定分析。结果表明,ITS序列分析在阪崎克罗诺杆菌鉴定中具有一定的优越性,且研究发现,ITS序列中含有两种功能基因tRNAgul和tRNAile+ala,这为今后阪崎克罗诺杆菌的鉴定及ITS基因的进一步分析提供了可供参考的理论依据。