力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

细胞结构的张力完整性

张力完整性结构由承受压力构件和一系列连续的张力构件相互连接组成.这种结构的稳定性取决于结构内部张力的完整性的保持,因而被称为张力完整性.生物学研究表明细胞的结构符合张力完整性原理.而且细胞骨架的张力完整性影响细胞的形状及其功能.应用张力完整性原理可解释细胞内力化学转导的一些基本规律.     

拉伸作用对成骨细胞粘附、铺展、粘弹性的影响

采用四点弯曲梁实验装置（自行研制）对离体培养的大鼠成骨细胞,施以拉伸应变影响,通过微管吸吮系统、显微摄录、计算机图像系统了解细胞的粘附、铺展行为和细胞的粘弹性变化,认识细胞形态、粘附力及变形性对机械刺激的响应。发现：（1）机械拉伸2h成骨细胞与基底粘附力以及细胞单位面积粘附力较对照组明显升高,但加载后期与对照无明显;（2）成骨细胞粘弹性较对照组略低;（3）加载24h(500με）实验组细胞增殖比对照组快。机械拉伸有成骨细胞生长,并可通过粘附、铺展调整、削减应变影响。     

成梯度增加的拉伸刺激对成骨细胞胶原合成的影响

使用四点弯曲加载装置研究机械拉伸对成骨细胞胶原合成的影响,在生理应变范围（500～1 500 με）研究了不同加载时间、不同应变水平对成骨细胞胶原合成的影响.发现在500 με下的拉伸刺激提高了成骨细胞合成胶原的能力,而在1 000 με和1 500 με下的拉伸刺激使成骨细胞的胶原合成受到了明显抑制（P＜0.01）.设计了应变成梯度增加的加载方式：使细胞在500 με加载一段时间后,将应变增加到1 000 με加载同样长的时间,最后将应变增加到1 500 με加载同样长的时间.在梯度加载实验中发现,成骨细胞接收到有利于其胶原蛋白合成的信号时,大量地吸收用于合成胶原的脯氨酸,当力学刺激变为抑制信号时,储存在胞内的³H-脯氨酸又重新释放回溶液中.说明在应变逐渐增加的加载过程中,细胞会进行自我调节以适应新的机械刺激.     

外力作为信号诱导基因的选择性剪接与力生长因子表达

许多种类的细胞都响应力信号,人们将这些细胞称为力效应细胞(mechanocyte).应力可引起细胞在基因水平或表达水平的调控,其中胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ,IGFⅠ)是力学敏感因子.对骨骼肌的长期拉伸实验发现,IGF-Ⅰ不仅表达量受到拉伸刺激的调控,而且存在多种变异体形式,其中一种对力刺激敏感,只在拉伸作用下产生,命名为力生长因子(mechano growth factor,MGF).进一步研究发现,MGF能激活卫星细胞、促进成肌细胞增殖,在治疗肌损失、预防心肌损伤和修复神经损伤等方面有重要的作用.机械拉伸也可以使成骨细胞表达MGF,研究表明,对成骨细胞施加应变为15%的周期性拉伸刺激,细胞的IGFⅠ表达量增加,同时表达MGF剪接变异体.对MGF的深入研究可望在疾病治疗和组织工程修复领域取得广泛的应用.     

成骨细胞对梯度拉伸应变的响应

采用四点弯曲加载装置对原代的大鼠颅盖骨细胞施加周期性的拉伸刺激,并设计了应变呈梯度增加的加载方式,使成骨细胞受到的拉伸应变为500－1500με,每隔2h增加500με,以考察成骨细胞对变化的力学环境的响应。结果表明,在500με下拉伸2－6h促进了成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活力增强和胞外钙基质沉积。对细胞施加应变呈梯度增加的拉伸刺激,则发现当应变从有利于细胞的生长分化水平（500με）变化为不利于细胞生长分化的水平（1000με,1500με）后,细胞的增殖指数、碱性磷酸酶活力和胞外钙基质分泌量都迅速降低,以适应新的力学环境。说明成骨细胞能够分辨不同的应变水平,并相应地调节自身的生理功能,从而表现出对变化的力学环境的适应。