牛γ 干扰素的表达及其抗病毒活性测定

通过RT-PCR从经ConA刺激诱导的奶牛脾脏淋巴细胞总RNA中扩增出牛γ干扰素 (BoIFN-γ) cDNA,克隆到真核载体pVAX1中,测序结果显示pVAX1中的插入序列BoIFN-γ基因与已报道序列一致。用重组质粒pVAX1-BoIFN-γ转染COS-7细胞并进行间接免疫荧光试验鉴定,结果显示BoIFN-γ在COS-7细胞中得到成功表达。将BoIFN-γ基因克隆到原核表达质粒pET-30a(+)、pGEX-6p-1后,分别转化重组表达菌BL21(DE3)、BL21后,通过对表达条件的优化,SDS-P     

牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法的建立

本研究旨在建立一种牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法,并评价该方法用于牛结核病检测的价值。通过筛选与天然牛γ干扰素特异性结合的单克隆抗体分别作为包被抗体和检测抗体,并探索不同的实验条件确定最佳包被抗体浓度、最佳细胞数量和最佳检测抗体浓度等,建立牛γ干扰素ELISPOT检测方法。采集30头奶牛尾静脉血并分离外周血单个核细胞,以结核菌素作为刺激原,使用建立的ELISPOT检测方法进行牛结核病检测,并与BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果进行比较。筛选到两株与天然牛γ干扰素特异性结合的单抗2G5和5E11,确定ELISPOT检测方法的最佳实验条件为:包被抗体2G5浓度2.5μg/m L,每孔细胞数量2.5×105个,检测抗体Bio-5E11浓度1μg/mL。使用建立的ELISPOT检测方法与BOVIGAMTM ELISA试剂盒对30头奶牛进行同步检测,结果显示,以BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测结果作为参考标准,14头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阳性牛中,ELISPOT方法检出的阳性牛为11头,敏感性为78.6%(11/14);16头BOVIGAMTM ELISA试剂盒检测阴性牛中,ELISPOT方法检出的阴性牛为12头,特异性为75%(12/16)。应用结核菌素作为刺激原的牛结核γ干扰素ELISPOT检测方法可用于牛结核病辅助检测,具有潜在的临床应用价值。