茶尺蠖和灰茶尺蠖内共生菌Wolbachia的分子检测及序列分析

【目的】对茶尺蠖Ectropis obliqua及其近缘种灰茶尺蠖E.grisescens体内共生菌Wolbachia进行分子鉴定,确定两者体内Wolbachia的感染率及其进化地位,为进一步探讨其对茶尺蠖和灰茶尺蠖的潜在影响提供科学依据。【方法】采用Wolbachia的16S r RNA、fts Z和wsp基因特异性引物,通过PCR扩增法检测了我国3个茶尺蠖地理种群(浙江杭州、余杭和江苏无锡)和3个灰茶尺蠖地理种群(浙江新昌、湖北浠水和江西南昌)中Wolbachia的感染情况,并进行测序和序列分析。【结果】茶尺蠖和灰茶尺蠖都感染了Wolbachia,灰茶尺蠖的Wolbachia感染率为100%,但茶尺蠖的Wolbachia感染率在22%~95%,且PCR产物电泳得到的条带微弱。wsp序列在茶尺蠖和灰茶尺蠖种间、种内无差异;但16S r RNA序列在茶尺蠖和灰茶尺蠖种间、种内差异为0.362%~0.727%之间;茶尺蠖样本未成功扩增出fts Z序列,灰茶尺蠖样本获得2条fts Z基因序列差异为1.647%。基于Wolbachia的16S r RNA和wsp基因构建的系统发育树表明,本研究中茶尺蠖和灰茶尺蠖种群所感染的Wolbachia全部属于B组的Pip亚组。【结论】茶尺蠖和灰茶尺蠖均被B组Pip亚组的Wolbachia感染,但感染率相差很大,这为研究Wolbachia对茶尺蠖和灰茶尺蠖生物学及生态学的影响奠定了基础。     

嗜热毛壳菌纤维素酶（CBHⅡ）cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

嗜热毛壳菌Chaetomium thermophilum CT2是一种土壤腐生菌,可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RACE-PCR获得嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）的编码基因(cbh2)。DNA序列分析表明cbh2的开放阅读框由1428个碱基组成,编码476个氨基酸。推断的氨基酸序列包含一个典型真菌纤维素酶的糖结合域（CBD）、催化域（CD）以及二者之间富含脯氨酸和羟基氨基酸的连接桥。根据氨基酸序列推算该酶分子量为53kD,属于糖苷水解酶第六家族,具有该家族催化保守区的典型特征。PCR扩增cbh2的成熟蛋白编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶蛋白的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.2 mg/mL。经硫酸铵沉淀、DEAESepharose Fast flow阴离子层析等步骤纯化了该重组表达蛋白。SDS-PAGE得到重组蛋白分子量为67kD,与从嗜热毛壳菌中纯化的该酶分子量一致。该重组纤维二糖水解酶作用的最适合温度50℃,最适pH4.0,在70℃的半衰期为30min,具有较好的热稳定性。     

7种寄主和非寄主植物气味对茶尺蠖成虫行为的调控效应

为探讨茶园生态系中植物气味对茶尺蠖成虫行为的影响,遂以茶园群落中7种常见植物新鲜嫩梢为味源,设1.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0g和30.0g剂量,洁净空气为CK1,用Y型嗅觉仪对茶尺蠖成虫进行的剂量反应结果为:①剂量为1.5g时寄主薄荷诱得的成虫数与CK1的差异显著;随着剂量增加,其诱得成虫数呈抛物线式递减;剂量为30.0g时其诱得成虫数显著小于CK1。②随着剂量的加大,寄主迷迭香、茶叶和吸毒草诱得成虫数呈抛物线式递增,剂量分别为7.5、10.0g和15.0g、以及10.0g时,3种寄主分别与CK1引诱成虫数的差异显著;当剂量再加大,3种寄主皆表现驱避效应,当剂量为30.0g时迷迭香诱得成虫数显著小于CK1。③当剂量为1.5g时,寄主万寿菊呈微弱引诱效应,当剂量再增加时则呈微弱驱避效应且驱避效应增强,当剂量为30.0g时其诱得成虫数显著小于CK1。④当剂量为5.0g时,寄主碰碰香无引诱或驱避效应;剂量为7.5g时,碰碰香呈微弱引诱效应;当剂量再增加时则呈微弱驱避效应。⑤当剂量为5.0、7.5、10.0g,非寄主薰衣草未呈现引诱或驱避;当剂量再增加时则呈驱避效应;当剂量为30.0g时其诱得成虫数显著小于CK1。再以正己烷为溶剂,取新鲜薄荷、万寿菊、茶叶嫩梢榨汁,汁液浸泡橡皮头24h以汲取气味,制成诱芯,气味以当量计算,即1.5g薄荷/诱芯、0.75g薄荷/诱芯、1.5g万寿菊/诱芯、1.5g茶叶/诱芯;以正己烷浸泡橡皮头24h作为CK2。诱芯附于土黄色粘板组成诱捕器,连续7d诱捕第5代成虫,每日更换色板,均有较强诱捕效应;从1.5g薄荷/诱芯、CK2、1.5g万寿菊/诱芯、0.75g薄荷/诱芯至1.5g茶叶/诱芯,诱效显著增加;1.5g薄荷/诱芯的诱效显著弱于CK2。在第5代茶尺蠖幼虫期,取1/6hm2茶园各3个作为诱捕小区,同样大小的3块茶园作为CK3,查虫口基数。第5代发蛾盛期,在每诱捕小区均匀放置5种诱捕器各7只,连续诱捕7日,每日更换色板,第6代幼虫虫口校正下降率30%。由试验结果认为:植物气味有效调节茶尺蠖成虫行为,薄荷诱效稍强于茶叶,熏衣草有驱避效应。     

虫害诱导的植物挥发物代谢调控机制研究进展

长期受自然界的非生物/生物侵害,植物逐步形成了复杂的防御机制,为防御植食性昆虫的为害,植物释放虫害诱导产生的挥发性化合物(herbivore-induced plant volatiles,HIPVs)。HIPVs是植物-植食性昆虫-天敌三级营养关系之间协同进化的结果。HIPVs的化学组分因植物、植食性昆虫种类的不同而有差异。生态系统中,HIPVs可在植物与节肢动物、植物与微生物、虫害植物与邻近的健康植物、或同一植株的受害和未受害部位间起作用,介导防御性反应。HIPVs作为寄主定位信号,在吸引捕食性、寄生性天敌过程中起着重要作用。HIPVs还可以作为植物间信息交流的工具,启动植株的防御反应而增强抗虫性。不论从生态学还是经济学角度来看,HIPVs对于农林生态系中害虫综合治理策略的完善具有重要意义。前期的研究在虫害诱导植物防御的化学生态学方面奠定了良好基础,目前更多的研究转向阐述虫害诱导植物抗性的分子机制。为了深入了解HIPVs的代谢调控机制,主要从以下几个方面进行了综述。因为植食性昆虫取食造成的植物损伤是与昆虫口腔分泌物共同作用的结果,所以首先阐述口腔分泌物在防御反应中的作用。挥发物诱导素volicitin和β-葡萄糖苷酶作为口腔分泌物的组分,是产生HIPVs的激发子,通过调节伤信号诱发HIPVs的释放。接着阐述了信号转导途径对HIPVs释放的调节作用,并讨论了不同信号途径之间的交互作用。就HIPVs的代谢过程而言,其过程受信号转导途径(包括茉莉酸、水杨酸、乙烯、过氧化氢信号途径)的调控,其中茉莉酸信号途径是诱发HIPVs释放的重要途径。基于前人的研究,综述了HIPVs的主要代谢过程及其过程中关键酶类的调控作用。文中的HIPVs主要包括萜烯类化合物、绿叶挥发物和莽草酸途径产生的芳香族化合物,如水杨酸甲酯和吲哚等。作为化学信号分子,这些化合物中的一部分还能激活邻近植物防御基因的表达。萜烯合酶是各种萜烯类化合物合成的关键酶类,脂氧合酶、过氧化氢裂解酶也是绿叶挥发物代谢途径中的研究热点,而苯丙氨酸裂解酶和水杨酸羧基甲基转移酶分别是合成水杨酸及其衍生物水杨酸甲酯的关键酶类。这些酶类的基因在转录水平上调控着HIPVs代谢途径。最后展望了HIPVs的研究前景。     

嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达

嗜热毛壳菌ChaetomiumthermophilumCT2可产生具有重要工业生产价值的纤维素酶类。RT-PCR扩增cbh1成熟蛋白的编码基因,利用基因重组的方法构建可在毕赤酵母分泌表达系统中表达纤维二糖水解酶的重组表达载体,并转化毕赤酵母得到重组子。在毕赤酵母醇氧化酶AOX1基因启动子的作用下,重组蛋白得到高效表达,小规模发酵量达1.42mg/mL。表达蛋白分泌到培养基中,分子量约80kD;以脱脂棉为底物测得酶活为21U/mL。表达蛋白在60℃稳定,70℃保温60分钟仍保持90%的酶活力,具有较高的热稳定性。