沃尔巴克氏菌调控小茶尺蠖和灰茶尺蠖杂交卵孵化

【目的】明确沃尔巴克氏菌Wolbachia对茶尺蠖两近缘种杂交卵孵化的影响及相关机制。【方法】使用2.5 mg/mL四环素浸液处理1 min后的新鲜茶树叶片连续饲喂灰茶尺蠖Ectropis grisescens幼虫3代,建立不携带Wolbachia的灰茶尺蠖种群。通过携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖成虫分别与小茶尺蠖E. obliqua成虫进行杂交,探究Wolbachia对二者杂交卵孵化的影响。同时利用iTRAQ技术检测并分析携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖精子蛋白的差异。【结果】与自然携带Wolbachia的灰茶尺蠖相比,去除Wolbachia后的灰茶尺蠖与小茶尺蠖杂交卵孵化率从3.92%显著提高到56.20%,表明Wolbachia诱导胞 质不亲合。精子蛋白差异分析显示,携带和不携带Wolbachia的灰茶尺蠖的精子蛋白中,共有128个蛋白显著差异表达,其中KEGG数据库注释到45个差异蛋白富集到鞘脂类代谢、唾液分泌、溶酶体、鞘脂信号通路和鞘糖脂生物合成等106个通路中,其中鞘脂类代谢通路中与神经酰胺合成相关的神经酰胺酶和磷酸酯酶显著上调表达。【结论】共生菌Wolbachia通过胞质不亲和作用介导了茶尺蠖两近缘种间的合子前生殖隔离,导致杂交卵的孵化率显著下降;Wolbachia可能通过鞘脂代谢通路实现了对雄性精子蛋白的修饰。     

我国桃蛀螟四个地理种群感染Wolbachia的研究

Wolbachia是一类广泛分布于节肢动物体内的细胞内共生菌,能参与调控寄主的多种生殖活动.桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)可危害多种粮食作物和经济作物,近年来已成为我国玉米生产的重要害虫之一.本研究对通过对16S rRNA、fts以及wsp基因片断的PCR扩增,对我国桃蛀螟4个地理种群进行了Wolbachia感染检测,并对感染个体中wsp基因片断克隆测序,初步探究了我国桃蛀螟种群中Wolbachia的感染率和感染类群.研究结果表明我国4个桃蛀螟种群中Wolbachia感染率在2.0%～8.0%,平均感染率为4.5%.通过对不同种群感染的Wolbachia中wsp序列比对及系统树构建分析,在桃蛀螟中发现了5种Wolbachia亚型,分别命名为wPun1-wPun5,分属于A组的Uni、Dro亚组,以及B组的Div、Con亚组.此外,本研究在采自河北保定的桃蛀螟种群中发现了Wolbachia的超感染现象.     

不同茶园灰茶尺蠖和茶尺蠖对5种杀虫剂的抗药性监测

为了明确茶园暴食性害虫灰茶尺蠖Ectropis grisescens和茶尺蠖E. obliqua抗药性现状，制定有效的防治措施，本研究采用浸叶法分别测定了5种茶园常用杀虫剂对5个地理种群灰茶尺蠖和2个地理种群茶尺蠖的抗药性。结果表明，不同茶园灰茶尺蠖和茶尺蠖对供试药剂的抗性水平存在差异：浙江兰溪、浙江金华、河南南阳地区的灰茶尺蠖种群和浙江杭州、浙江安吉的茶尺蠖种群对联苯菊酯产生了中高等抗性；浙江杭州的茶尺蠖种群对苦参碱的抗性达到中等水平，其余供试种群对苦参碱抗性处于敏感水平；所有供试种群对虫螨腈、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和茚虫威这3种药剂的抗性均处于敏感水平。从化学防治的角度来看，目前茶园灰茶尺蠖和茶尺蠖对虫螨腈、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和茚虫威敏感性高，抗性低，推荐合理科学使用，并避免长期使用单一农药。     

山东不同地区韭菜迟眼蕈蚊共生菌Wolbachia 的检测及鉴定

【目的】为了揭示山东省韭菜迟眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang种群共生菌 Wolbachia 的感染率及其分类地位,探讨该共生菌对韭菜迟眼蕈蚊的潜在影响。【方法】利用线粒体细胞色素氧化酶I（mtCOI）基因引物（LCO1490/HCO2198）,通过扩增测序和序列比对对采自山东省12个地区的根蛆种群进行了分类鉴定。在上述基础上,利用 Wolbachia 的16S rDNA和 wsp 基因特异引物（分别为16S-F/16S-R和81F/691R）对鉴别出的11个韭菜迟眼蕈蚊种群体内Wolbachia 感染情况进行了PCR检测;对感染个体体内 Wolbachia 依据16S rDNA基因片段序列进行分类鉴定。【结果】山东省12个根蛆种群中,11个种群为韭菜迟眼蕈蚊种群。基于 Wolbachia 的16S rDNA基因特异引物检测结果发现,这些韭菜迟眼蕈蚊种群广泛感染 Wolbachia （感染率为6.67%~93.33%）,而利用wsp 基因特异引物检测的感染率（0.00%~40.00%）相对较低些。基于 Wolbachia 的16S rDNA基因构建系统发育树表明,这些韭菜迟眼蕈蚊种群感染的Wolbachia 全部属于A组。【结论】确定了 Wolbachia 在山东省韭菜迟眼蕈蚊体内的感染率及其分类地位,为研究 Wolbachia 对韭菜迟眼蕈蚊生物学及生态学的影响奠定了基础。     

茶核·苏云菌悬浮剂对灰茶尺蠖的田间防控应用

【目的】茶尺蠖核型多角体病毒EcobNPV是一种重要的昆虫病原微生物,可侵染茶尺蠖Ectropis obliqua和灰茶尺蠖Ectropisgrisescens2种宿主。为探明茶尺蠖核型多角体病毒制剂的田间应用技术,对影响防效的3个因子喷施方式、剂量和虫龄进行研究。【方法】采用植保无人机和人工喷施2种喷施方式,比较茶核·苏云菌悬浮剂（1×104 PIB·2 000 IU/μL）防治灰茶尺蠖的效果;设置75、150和375 mL/667 m²3种剂量,比较茶核·苏云菌悬浮剂对灰茶尺蠖的防治效果;并比较其对灰茶尺蠖1龄、2龄和3龄不同虫龄的防治效果。【结果】在相同剂量下,用植保无人机和人工喷施病毒制剂对灰茶尺蠖的总防效分别为69.0%和67.6%,两者无显著差异;在75、150和375 mL/667 m23种剂量,比较茶核·苏云菌悬浮剂对灰茶尺蠖的防治效果;并比较其对灰茶尺蠖1龄、2龄和3龄不同虫龄的防治效果。【结果】在相同剂量下,用植保无人机和人工喷施病毒制剂对灰茶尺蠖的总防效分别为69.0%和67.6%,两者无显著差异;在75、150和375 mL/667 m² 3种剂量下病毒制剂对灰茶尺蠖的防效差异显著,其中375 mL/667 m2 3种剂量下病毒制剂对灰茶尺蠖的防效差异显著,其中375 mL/667 m²剂量下的防效最高,150 mL/667 m2剂量下的防效最高,150 mL/667 m²其次,150 mL/667 m2其次,150 mL/667 m²和375 mL/667 m2和375 mL/667 m²剂量对灰茶尺蠖的总防效均在90%以上;病毒制剂对灰茶尺蠖1龄、2龄和3龄幼虫的防效分别为93.3%、78.7%和67.8%,对1龄幼虫的防效显著高于3龄。【结论】茶核·苏云菌悬浮剂防治灰茶尺蠖可选用植保无人机喷施,剂量可选用150-375 mL/667 m2剂量对灰茶尺蠖的总防效均在90%以上;病毒制剂对灰茶尺蠖1龄、2龄和3龄幼虫的防效分别为93.3%、78.7%和67.8%,对1龄幼虫的防效显著高于3龄。【结论】茶核·苏云菌悬浮剂防治灰茶尺蠖可选用植保无人机喷施,剂量可选用150-375 mL/667 m²,以1龄幼虫期喷施防效为最佳。     

河南不同地区棉蚜种群共生菌Wolbachia的检测及系统发育分析

【目的】本研究旨在揭示河南省不同地区棉蚜Aphis gossypii种群共生菌Wolbachia的感染情况,明确Wolbachia的感染类型及分类地位。【方法】2016-2017年间采集河南省不同地区的13个棉蚜种群,通过扩增COI基因片段对其进行种类鉴定;通过扩增棉蚜种群中Wolbachia的wsp基因片段对其进行Wolbachia感染率的检测,应用neighbor-joining法构建系统进化树进行棉蚜种群中Wolbachia的系统发育分析。【结果】对河南省内不同地区采集的13个棉蚜种群的Wolbachia感染率而言,郑州(ZZ)种群最高(46.67%),信阳2(XY2)种群最低(6.67%),13个种群Wolbachia的感染率范围为6.67%～46.67%,平均感染率为28.35%。基于wsp基因构建的系统发育树表明,安阳和信阳的棉蚜种群感染的Wolbachia株系属于B大组,其余地区棉蚜种群感染的Wolbachia株系属于A大组。【结论】河南省不同地区的棉蚜种群Wolbachia感染率差别较大,且不同种群感染的Wolbachia株系分别属于A大组或B大组。     

华南地区柑橘木虱与柑橘粉虱内共生菌检测及其Wolbachia共生菌的系统发育关系分析

【目的】探明不同地理种群的柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama和柑橘粉虱Dialeurodes citri Ashmead体内昆虫内共生菌的种类及其感染率,并以Wolbachia共生菌为代表,对其系统发育关系进行分析,为今后自共生菌角度研发柑橘木虱和柑橘粉虱的新型防控技术奠定基础。【方法】以16S r DNA、23S r DNA以及wsp为目标基因,利用PCR技术检测采自于广州、湛江、南宁、桂林、厦门的柑橘木虱以及采自广州的柑橘粉虱体内共生菌的种类及其感染率;利用多位点序列分型(MLST)技术和MEGA 5.0软件对不同昆虫样本中的Wolbachia进行系统发育关系分析。【结果】本研究采集的柑橘木虱和柑橘粉虱均含有原生共生菌Portiera和次生共生菌Wolbachia、Cardinium、Rickettsia,但该3种次生共生菌在不同木虱与粉虱种群的感染率有所不同;Arsenophonus只在广州和湛江种群的柑橘木虱中检出。基于wsp基因及MLST基因序列的Wolbachia系统发育分析表明,华南地区柑橘木虱和柑橘粉虱体内的Wolbachia均属于Wolbachia的B大组Con亚组。【结论】不同地理种群的柑橘木虱与柑橘粉虱体内感染的共生菌种类及其感染率不同;Wolabchia共生菌与柑橘木虱寄主不存在协同进化关系,在同一采集点存在Wolbachia通过柑橘寄主在柑橘木虱之间、柑橘木虱与柑橘粉虱之间水平传播的可能性。     

食物对四个茶尺蠖地理种群发育和生殖的影响

【目的】明确不同成熟度茶树叶片对浙江等4个地理种群茶尺蠖Ectropis oblique Prout发育和生殖的影响,旨在揭示不同地理种群茶尺蠖对不同质量食物的适应力差异,为制定各地茶尺蠖种群的差异化防治策略提供依据。【方法】通过对浙江、湖北、福建和江西等地茶尺蠖种群饲喂嫩叶、成叶和老叶3种不同成熟度的茶树叶片后,对比研究其发育历期、死亡率以及内禀增长率等生长发育与生命表参数。【结果】不同地理种群茶尺蠖发育历期存在显著差异,且均以成叶处理发育历期最短;幼虫3龄前死亡率以老叶处理死亡率最高(达33%),嫩叶处理最低(达15%),每雌产卵量以嫩叶处理最高(达362.23粒),老叶处理最低(达56.67粒);在内禀增长率、净繁殖率、种群加倍时间、周限增长率等5个生命表参数方面,各地理种群在成叶处理下差异不显著(P>0.05),嫩叶和老叶处理下差异显著(P<0.05)。通过茶树叶片内含物与茶尺蠖发育相关性分析,发现不同地理种群生命参数与各物质成分的相关性不尽一致,分别有2种物质与湖北种群、江西种群相关性最大,分别有1种物质与浙江种群、福建种群密切相关。【结论】浙江、福建、湖北和江西4地区茶尺蠖种群在取食适应性方面存在明显差异。其中,浙江种群取食不同发育成熟度茶树叶片后的适应性较强,在幼虫期存活率、每雌产卵量和世代净繁殖率(R0)等重要参数方面都较突出;而湖北种群对老叶这一不良食物的适应能力最弱(死亡率最高、净繁殖率较低);江西种群对老叶的适应能力较弱(死亡率较高、净繁殖率最低)。     

浙江茶尺蠖地理种群已分化成为不同种

【目的】明确茶尺蠖Ectropis obliqua Prout不同地理种群的种群分化和生殖隔离程度。【方法】对分别在浙江杭州和衢州两地田间采集的茶尺蠖杭州种群（H）和衢州种群（Q）两个种群,进行形态学鉴定、生物学特征观察以及正反交试验。【结果】形态学与生物学观察结果表明,除Q种群的体形较大和体翅颜色略深外,两个种群的外部形态、生殖器解剖结构和雌蛾产卵量等基本相同。遗传杂交试验结果表明,无论是正交还是反交,杂交后均能获得子一代（F1）;与种群内自交相比,杂交后雌成虫的产卵量下降,卵的孵化率显著降低;幼虫的历期明显缩短且化蛹时间分布不规则,蛹重变轻;蛹的羽化率降低,羽化的成虫雌雄性比严重失调。【结论】茶尺蠖杭州种群（H）和衢州种群（Q）两个种群存在生殖隔离,有明显的种群分化,应属于不同种。     

我国华东地区两种茶尺蛾的形态和分子鉴定

【目的】我国华东地区两种严重危害茶树的害虫灰茶尺蛾Ectropis grisescens Warren,1894和茶尺蠖Ectropis obliqua(Prout,1915)的形态相似、分类不清,在农业生产中常常混淆,给防治工作的开展带来了相当大的困难。为了准确的鉴别灰茶尺蛾和茶尺蠖,本文对这两种害虫进行了形态学观察和分子特征分析。【方法】对灰茶尺蛾和茶尺蠖成虫、卵、幼虫和蛹的形态特征进行了比较分析;并对灰茶尺蛾和茶尺蠖的39个样本的线粒体COⅠ基因进行了扩增和测序,分析了两物种种内和种间的遗传距离,并基于Kimura-2-parameter模型,利用ML和NJ法构建系统发育树。【结果】灰茶尺蛾和茶尺蠖部分形态学特征具有显著差异;分子数据表明二者种内和种间遗传距离存在明显的"barcoding gap",利用ML和NJ法构建的系统发育树可以将灰茶尺蛾和茶尺蠖成功的区分开。【结论】基于COⅠ基因的分子鉴定结果与形态学鉴定结果相符合,可用于害虫防治和相关研究中。     

Prevailing triple infection with Wolbachia in Callosobruchus chinensis (Coleoptera: Bruchidae)

Prevailing triple infection with three distinct Wolbachia strains was identified in Japanese populations of the adzuki bean beetle, Callosobruchus chinensis. When a polymerase chain reaction (PCR) assay was conducted using universal primers for ftsZ and wsp, Wolbachia was detected in all the individuals examined, 288 males and 334 females from nine Japanese populations. PCR-restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of cloned wsp gene fragments from single insects revealed that three types of wsp sequences coexist in the insects. Molecular phylogenetic analysis of the wsp sequences unequivocally demonstrated that C. chinensis harbours three phylogenetically distinct Wolbachia, tentatively designated as wBruCon, wBruOri and wBruAus, respectively. Diagnostic PCR analysis using specific primers demonstrated that, of 175 males and 235 females from nine local populations, infection frequencies with wBruCon, wBruOri and wBruAus were 100%, 96.3% and 97.0%, respectively. As for the infection status of individuals, triple infection (93.7%) dominated over double infection (6.1%) and single infection (0.2%). The amounts of wBruCon, wBruOri and wBruAus in field-collected adult insects were analysed by using a quantitative PCR technique in terms of wsp gene copies per individual insect. Irrespective of original populations, wBruCon and wBruOri (107 -108 wsp copies/insect) were consistently greater in amount than wBruAus (106 -107 wsp copies/insect), suggesting that the population sizes of the three Wolbachia strains are controlled, although the mechanism is unknown. Mating experiments suggested that the three Wolbachia cause cytoplasmic incompatibility at different levels of intensity.     

几种常见桔园螨类Wolbachia基因检测与序列分析

应用共生菌沃尔巴克氏体Wolbachia的wsp、ftsZ和16SrDNA基因特异引物,通过PCR扩增法对采自江西省南昌、九江和赣州等3地桔园内的东方钝绥螨、江原钝绥螨、尼氏真绥螨、巴氏新小绥螨、桔全爪螨和酢浆草如叶螨等6种常见螨类进行了检测。结果表明,在采自南昌桔园内的酢浆草如叶螨体内检测到Wolbachia感染,其wsp、ftsZ和16SrDNA基因长度为593、758和896bp,Genbank登录号依次为GQ162482、GQ162483和GQ162484,而其他5种螨体内均未检测出Wolbachia的感染;同时通过对酢浆草如叶螨体内感染的Wolbachia的wsp基因序列进行系统发育分析,得出其与B大组的Epo组的Wolbachia株十分相近,可能是相近或相同的株。     

Super-infections of Wolbachia in byturid beetles and evidence for genetic transfer between A and B super-groups of Wolbachia

Wolbachia are maternally inherited bacteria responsible for altering host reproduction. The two main groups found in insects, A and B, are based on molecular characterization using ribosomal, ftsZ, wsp (Wolbachia surface protein) or groE genes. We have used the wsp and ftsZ genes to study Wolbachia in byturid beetles. Byturus affinis contained a single copy of the ftsZ gene which grouped with A ftsZ sequences and a single copy of the wsp gene which grouped with B wsp sequences. This suggests that genetic exchange between A and B groups has occurred in the Wolbachia of this beetle. FtsZ and wsp sequences that were identical or nearly identical to those of B. affinis were found in B. tomentosus, suggesting that it also contains the same recombinant Wolbachia genotype. Most other byturids had more than one wsp sequence with at least one from the A and B groups, suggesting multiple copies of bacterial genes or multiple infections. B. ochraceus and B. unicolor both had four distinct wsp gene sequences. All the byturids had a closely related A wsp sequence and most a closely related B wsp sequence. Therefore, there appears to be an association between specific A and B wsp types.     

Diversity of Wolbachia isolated from the Cubitermes sp. affinis subarquatus complex of species (Termitidae), revealed by multigene phylogenies

Wolbachia are endosymbiotic bacteria that may alter the reproductive mechanisms of arthropod hosts. Eusocial termites provide considerable scope for Wolbachia studies owing to their ancient origin, their great diversity and their considerable ecological, biological and behavioral plasticity. This article describes the phylogenetic distribution of Wolbachia infecting termites of the Cubitermes genus, which are particularly abundant soil-feeders in equatorial Africa. Fourteen colonies of the Cubitermes sp. affinis subarquatus complex of species were screened using five bacterial genes (wsp, ftsZ, coxA, fbpA and 16S rRNA genes) and a striking diversity of Wolbachia strains was identified within these closely related species. In the host complex, three Wolbachia variants were found that were not in the super groups usually reported for termites (F and H), each infecting one or two Cubitermes species.     

水稻二化螟内共生菌杀雄菌属和沃尔巴克氏体的检测与分析

应用杀雄菌属(Arsenophonus)23S rDNA基因和沃尔巴克氏体(Wolbachia) wsp基因的特异引物,通过PCR扩增的方法对我国20个水稻二化螟地理种群感染两类内共生菌的情况进行了检测.结果表明: 我国水稻二化螟不同地理种群的Arsenophonus和Wolbachia感染率不一致,哈尔滨、惠水、吉林、南阳和扬州5个地理种群的Arsenophonus感染率为5.0%～50.0%;汉中、南宁和扬州3个地理种群的Wolbachia感染率为25.0%～40.0%,其他地理种群中没有检测到这两种共生菌的存在.水稻二化螟不同地理种群感染的Arsenophonus 23S rDNA基因序列完全一致,将该基因株型命名为csArs.但所检测到的Wolbachia wsp基因序列不一致,分别为wChisup1、wChisup5和wChisup6,其中wChisup1属于A群,其他属于B群.这说明水稻二化螟感染的Arsenophonus为同一株型,而感染的Wolbachia株型较为复杂.通过构建系统发育树发现,水稻二化螟体内的Arsenophonus23S rDNA基因和Wolbachia wsp基因与其他物种体内相关序列完全一致或高度相似.     

Molecular evidence for the endosymbiont <Emphasis Type="BoldItalic">Wolbachia</Emphasis> in a non-filaroid nematode, <Emphasis Type="BoldItalic">Angiostrongylus cantonensis</Emphasis>

Wolbachia harbored by most filarial parasites, is critical to both embryogenesis and microfilarial development, and may lead to inflammation and pathogenesis in infected hosts. Based on alignment of the sequences from the wsp, ftsZ, and 16S rRNA genes, Wolbachia was demonstrated to exist in Angiostrongylus cantonensis, a non-filaroid nematode. Although the wsp gene may not be the best candidate for evolutionary analysis of Wolbachia, this gene has been sequenced from a broader coverage of the host species, making it feasible to be used for phylogenetic analysis in this study. The results from both Neighbor-joining and Maximum parsimony methods showed that this novel Wolbachia does not belong to any of the known groups (C or D) of nematode-derived Wolbachia. In addition, the wsp gene sequence of this newly identified endosymbiont revealed a high degree of identity (98%) with that from Diaea circumlita c2, tentatively classified into the putative group G. This suggests that Wolbachia from A. cantonensis could represent a deeply branched lineage in Wolbachia evolution or the occurrence of horizontal transfer between infected hosts. In conclusion, the findings provide some insights into our understanding of the evolution of Wolbachia, particularly the isolate from A. cantonensis.     

朱砂叶螨体内感染的Wolbachia的wsp基因序列测定与分析

应用Wolbachia的wsp基因特异引物,通过PCR扩增法对我国朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus7个地理种群进行了检测。在采自黑龙江佳木斯、安徽安庆、江苏镇江和浙江慈溪的4个地理种群中扩增出了596bp左右的Wolbachia的wsp基因片段,而在河北威县、山东滨州和湖北赤壁3个地理种群中未发现这个Wolbachia特征基因片段,表明 Wolbachia在我国朱砂叶螨中的侵染较为普遍。通过对我国朱砂叶螨体内感染的 Wolbachia的wsp基因序列进行系统发育分析,得出它们全部与B大组的Ori组的Wolbachia株十分相近或完全相同,提示它们可能是相近或相同的株。     

湖南三地区麦氏安瘿蜂体内Wolbachia 的感染及其wsp基因序列分析

为检测麦氏安瘿蜂Andricus mairei Kieffer有无Wolbachia感染, 本研究对其岳阳、 长沙和邵阳3种群雌、 雄成虫体内Wolbachia的wsp基因进行了PCR检测, 进而对获得的基因片段进行了序列分析。结果显示, 麦氏安瘿蜂岳阳、 长沙及邵阳种群雌、 雄成虫均有Wolbachia感染, 除邵阳种群雌成虫的感染率为80%之外, 其他均为100%。3个种群Wolbachia的wsp基因序列长度皆为561 bp, 且序列完全一致。麦氏安瘿蜂Wolbachia的wsp基因序列与已知瘿蜂族(Cynipini) Neuroterus macropterus、 Biorhiza pallida及Andricus solitarius （strain 1）以及Synergini族Synergus crassicornis感染的Wolbachia的一致性达95%。除Synergini族Ceroptres cerri感染的Wolbachia属于B群（B group）之外, 瘿蜂感染的Wolbachia均属于A群（A group）。在NJ系统树中, 麦氏安瘿蜂与瘿蜂族Neuroterus macropterus、 Biorhiza pallida和Andricus solitarius （strain 1）及Synergini族Synergus crassicornis感染的Wolbachia聚合在同一分支。此外, 麦氏安瘿蜂岳阳、 长沙和邵阳种群均获得了雌、 雄成虫, 其雌性率分别为15.3%, 12.1%和19.8%, 表现出明显的雄性比偏高。结果提示与瘿蜂族的其他已报道的种类一样, Wolbachia与麦氏安瘿蜂的共生并不诱导其营产雌孤雌生殖。