钝齿棒杆菌的代谢改造：L-鸟氨酸与L-瓜氨酸合成菌株的构建

【目的】对一株产L-精氨酸的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5进行代谢工程改造,构建L-鸟氨酸和L-瓜氨酸合成菌株,并考察其发酵生产相应氨基酸的性能。【方法】分别敲除菌株SYPA5-5鸟氨酸氨甲酰转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)的编码基因argF和精胺琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)的编码基因argG,构建能够合成L-鸟氨酸及L-瓜氨酸的重组菌株SYPA5-5△argF和SYPA5-5△argG;考察不同营养条件对上述重组菌株生长和相应氨基酸积累的影响。【结果】添加0.3 g/L L-精氨酸可满足SYPA5-5△argF的生长及L-鸟氨酸积累所需,L-鸟氨酸产量可达21.5 g/L;添加L-精氨酸有利于SYPA5-5△argG的生长,但不利于L-瓜氨酸的积累;不添加L-精氨酸时,L-瓜氨酸产量可达15.2 g/L,同时积累6.8 g/L的L-谷氨酸。【结论】分别敲除L-精氨酸生产菌株SYPA5-5的argF及argG基因,可实现L-精氨酸合成途径的中间代谢物L-瓜氨酸和L-鸟氨酸的积累,拓展了该菌株的工业应用范围。     

游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成

【目的】解析Actinoplanes sp.SE50/110(简称SE50/110)中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成机制。【方法】经过BLASTp分析,推测了Acb A、Acb B和Acb V负责阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成。首先,本研究在SE50/110中分别构建了acb A、acb B和acb V的同框缺失和回补突变株。然后,利用大肠杆菌BL21(DE3)/p Gro7分别对Acb A、Acb B和Acb V成功实现了可溶性表达。最后,以D-葡萄糖-1-磷酸为起始底物,通过体外催化反应,研究脱氧氨基糖单元的生物合成过程和相关蛋白的酶学性质。【结果】在SE50/110中分别缺失acb A、acb B和acb V基因后,相应突变株均丧失了阿卡波糖的合成能力,将acb A、acb B和acb V基因分别回补后,各菌株又恢复了阿卡波糖的合成能力,证明了它们均为阿卡波糖生物合成的必需基因。在体外酶促反应中,D-葡萄糖-1-磷酸-胸腺嘧啶转移酶Acb A催化D-葡萄糖-1-磷酸和d TTP合成d TDP-D-葡萄糖,对D-葡萄糖-1-磷酸的Km值为(0.185±0.053)mmol/L,Vmax为(2.366±0.217)μmol/(min·mg);对d TTP的Km值为(4.964±1.089)mmol/L,Vmax为(60.310±5.419)μmol/(min·mg)。d TDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶Acb B催化d TDP-D-葡萄糖转化为d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(0.353±0.089)mmol/L和(306.401±28.740)μmol/(min·mg)。氨基转移酶Acb V催化d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖生成d TDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(1.411±0.293)mmol/L和(3.447±0.279)μmol/(min·mg)。【结论】本研究阐明了阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成过程,为全面解析阿卡波糖生物合成途径奠定了基础。同时,测定了相关酶的动力学参数,为代谢工程改造SE50/110,提高阿卡波糖产量提供了重要的理论依据。     

阿卡波糖生物合成调控蛋白的钓取与功能解析

[目的] 发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量。[方法] 首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白。然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证。同时,利用大肠杆菌BL21（DE3）异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力。[结果] 经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子P_WV和P_AB结合的调控蛋白。在QQ-2中分别强化表达和缺失这9个调控基因后发现,基因ACPL_1889的强化表达使阿卡波糖产量提高25%,而该基因的缺失使产量降低22%;基因ACPL_5445、ACPL_3989的强化表达使阿卡波糖产量分别降低12%和39%,而这两个基因的缺失使产量分别提高15%和8%。对阿卡波糖生物合成基因转录水平的检测发现,强化表达基因ACPL_1889使acbA、acbB、acbW、acbV的转录水平升高,而缺失该基因使这4个基因的转录水平降低;敲除基因ACPL_5445使这4个基因转录水平均有提高;强化表达基因ACPL_3989使这4个基因的转录水平均下降,而其敲除使acbW和acbA的转录水平分别提高了约100倍和40倍。在凝胶阻滞实验中,ACPL_1889与ACPL_3989均能与acb基因簇的启动子区域结合。最后将正调控基因的强化表达和负调控基因的敲除进行组合,使阿卡波糖产量提升32%。[结论] 本研究发现了9个与阿卡波糖生物合成基因簇的启动子区域结合的调控蛋白,通过体内、体外实验证明ACPL_1889为阿卡波糖生物合成的正调控因子、ACPL_5445和ACPL_3989为负调控因子,不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础,而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量。