应用RAPD和ISSR标记对24份花生栽培种材料进行遗传多样性分析

利用RAPD引物和ISSR引物分析我国24份花生栽培种材料的遗传多样性.结果表明:所选的RAPD引物和ISSR引物中分别有13条引物和10条引物扩增出了清晰并可重复的条带,共扩增出123条带和87条带,平均每条引物扩增出9.5条带和8.7条带,其中多态性带分别占条带总数的47.15％和57.47％,平均每条引物扩增出4...     

油菜叶绿体乙酰辅酶A羧化酶单交换表达载体的构建

根据已知序列设计引物,通过PCR扩增获得质体定位的乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因序列。先将该酶4个亚基的基因进行拼接,然后将这4个拼接好的片段,克隆到pMD18-T载体上,得到质粒pH BM714。再以质粒pHBM714 DNA为模板,用分别带有CpoI和Asc I酶切位点的引物进行PCR扩增,PCR产物在dTTP的保护下经T4 DNA聚合酶处理,与将质粒pHBM720DNA纯化后经CpoI和AscI双酶切后得到的大片段连接,连接产物转化大肠杆菌Xl_(10)-gold,得到正确的重组子命名为pHBM726。此质粒pH BM726,即为带有壮观霉素抗性基因(aadA)筛选标记的质体定位的乙酰辅酶A羧化酶基因油菜叶绿体单交换表达载体;在此载体中壮观霉素抗性基因(aadA)、乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因(ACC)和绿色荧光蛋白基因(gfp)共6个基因串联在一起,共用一个启动子序列,一起来进行表达;通过酶切检测、PCR验证和测序验证,均表明该表达载体构建成功。最后此载体在大肠杆菌中表达时,发现重组菌能够在含壮观霉素的培养基上生长,且在可见光下,能看到绿色荧光,表明壮观霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因均在大肠杆菌中成功表达;表达产物通过Western印迹验证表明组成乙酰辅酶A羧化酶的4个亚基的基因在大肠杆菌中成功表达。以上结果表明,该表达载体中串联排列的这6个基因均在大肠杆菌中成功表达。该研究结果可为质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转叶绿体的研究奠定基础,为油菜油脂代谢研究提供参考。     

耐碱性甘露聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

通过功能平板从土壤中筛选得到含甘露聚糖酶基因的耐碱菌株。构建其基因组文库,从中筛选到甘露聚糖酶基因TM1并测序分析,用BLAST分析表明,TM1的氨基酸序列与其他在GenBank发表的甘露聚糖酶的氨基酸序列的同源性均低于60%,故确定其为一个新的甘露聚糖酶基因(GenBank登录号为AY623903)。将此基因去除信号肽后的编码序列克隆到表达载体pHBM905C上,得到重组质粒pHBM1201。经SalⅠ酶切后分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris)KM71、GS115、SMD1168,得到分泌表达的重组毕赤酵母。挑选相对表达量最高的重组毕赤酵母SMD1168-3在摇瓶中诱导产酶,对该酶的粗酶进行酶学性质分析表明,其最适反应温度为55℃,最适PH值为7.5,以魔芋粉为底物所测得的最高酶活为41.8U,半衰期为1h,在80℃保温5min其酶活由最初酶活的77%下降到11%,温度下降到55℃后活性可恢复到最初酶活的60%以上。