小鼠胚胎干细胞建系技术研究进展

目前,对小鼠胚胎干细胞的研究较为深入,并已成为研究细胞分化及信号转导、新基因发现及功能鉴定、器官发生、人类疾病和药物开发等的有效手段。胚胎干细胞建系是一项基础性工作。虽然技术日趋成熟,有些品系小鼠的胚胎干细胞建系已是常规技术,但不同品系小鼠胚胎干细胞的建系效率仍有很大差异,建系途径和方法各有特点,一个品系胚胎干细胞的建系方法不一定都适用于其他品系。本文从小鼠胚胎干细胞建系的途径、分离操作技术、培养体系等方面进行综述,并就与之相关的有些问题提出思考和对策。     

内皮祖细胞及其在组织工程中的应用

目前,组织工程化血管的构建和工程化组织器官的血管化因内皮种子细胞的扩增能力不足和生物活性不强而受到限制。内皮祖细胞(EPC)是内皮细胞的前体细胞。出生后,EPC主要存在于骨髓,可向外周血液缓慢释放,参与机体缺血组织的血管重建和损伤血管的重新内皮化。现对EPC的来源、分布、表型特征、动员、分化、归巢、分离、培养与鉴定等生物学特性和EPC在组织工程中的应用进行了全面的综述,并指出目前存在的问题和研究方向。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra（Stimulated by Retinoic Acid）基因。从鼠源分离得到的Stra8 基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8 基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8 基因的启动子序列（1.4kb）。将Stra8 基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8 基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8 的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8 和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

影响牛胚胎干细胞分离克隆因素的研究

采用与同源胎儿成纤维细胞共同培养及传统饲养层培养方式,以高糖DMEM,添加0.1mM2-巯基乙醇,犊牛血清,细胞因子为培养基,以4-13周龄屠宰牛胎儿为实验材料,探讨影响牛原始生殖细胞分离克隆胚胎干细胞的相关因素,结果发现：当犊牛血清为15%时效果最好;细胞因子添加与否对胚胎干细胞的分离及同源牛胎儿成纤维细胞的贴壁与生长影响并不显著,而在传代过程中中有一定影响;以0.2%胰酶 0.04?TA为细胞消化液效果最佳;以同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆牛胚胎干细胞,本研究观察到效果最好。     

胚胎干细胞生物学特性及其应用前景

胚胎干细胞是来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞的一类未分化的全能性多能性干细胞,具有无限增殖和全能分化的潜力。胚胎干细胞在发育生物学基础研究、动物胚胎工程研究生产和临床医学上具有诱人的应用前景。     

骨髓间充质干细胞分化为胰岛细胞治疗糖尿病

糖尿病已成为严重危害人类健康的疾病之一。目前,移植胰岛治疗糖尿病已初见疗效,但由于胰岛来源匮乏和免疫排斥反应而受阻。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs)取材方便,容易进行体外分离、培养和纯化,且具有跨越分化潜能。若将自体BMMSCs诱导分化为胰岛细胞,可望解决细胞来源和免疫排除问题,实现糖尿病的自体细胞治疗。现对体外诱导BMMSCs分化为胰岛细胞治疗糖尿病的研究进展进行综述,并指出了存在问题和今后的研究方向。     

单克隆人胰腺干细胞分化特性的研究

研究1例来源于4月龄男性流产胎儿胰腺组织的单克隆人胰腺干细胞（monoclonal human pancreatic stem cell,mhPSC）系的体内外分化特性。将mhPSCs接种在铺有0．1％明胶的培养皿内,扩增培养3d后,加高糖DMEM诱导液诱导培养25d。相差显微镜下．观察细胞生长状况。采用双硫腙染色法、RT—PCR及葡萄糖刺激释放胰岛素和C肽实验．对体外定向诱导mhPSCs分化为功能性胰岛进行检测。将mhPSCs悬液注射在成年雄性裸鼠腹股沟皮下．注射30d时,取出移植物,采用SP法进行免疫组织化学反应,以检测mhPSCs的体内自然分化潜能。体外扩增培养,mhPSCs贴壁生长,呈多角形上皮样。生长至单层．呈“铺路石”状。体外定向诱导,细胞逐渐由多角形变成圆形,并聚集成类胰岛。诱导培养15d时．形成的类胰岛中少数细胞分化为B细胞,双硫腙染色阳性。诱导培养25d时,多数细胞分化为8细胞,双硫腙染色阳性,转录表达胰岛素的mRNA。用不同浓度葡萄糖刺激．诱导胰岛不仅释放胰岛素和C肽,而且其释放量随糖刺激浓度升高显著增加（0．01〈P〈0．05）。体内分化实验显示,mhPSCs在裸鼠背部形成类畸胎瘤。类畸胎瘤易与裸鼠分离,色白,血管丰富。显著表达pdx1、胰岛素、胰高血糖素、CK、MBP及NF蛋白。该研究结果证实单克隆人胰腺干细胞系体外定向诱导分化为包含大量β细胞的功能性类胰岛,在体内自然分化为胰岛、上皮及神经组织细胞。     

胰腺干细胞生物学特性研究进展

胰腺干细胞是一类来源于胎儿或成年胰腺组织中的成体干细胞.多数研究认为胰腺干细胞体外培养时,贴壁生长,呈多角形上皮样,具有较高的扩增性;表达胰腺发育过程中的一些决定因子Pdx1、HNF3β、Ngn3、Th及Isll等,还共表达胰腺终末细胞释放的激素glucagon、insulin等,甚至共表达来源于其它胚层细胞的表达物CK19、nestin等;具有多分化潜能,其特点是在自然分化过程中,优先分化为胰腺组织细胞,在特定的条件下,也可转分化为其它组织细胞.胰腺干细胞生物学的不断深入研究,为分离、克隆胰腺干细胞及定向诱导其分化为功能性胰岛移植治疗人类糖尿病奠定了基础.     

山羊胚胎干细胞的分离与培养

对关中奶山羊配种后6～7天的桑椹胚和囊胚,分别采用全胚培养法、酶消化法和免疫外科法进行处理.将处理后的胚胎培养于小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层上,分离培养山羊胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC).对分离传代的山羊ESCs分别进行免疫组化染色,RT-PCR检测和体外诱导分化试验.结果表明.全胚培养法易于胚胎贴壁形成原代集落,采用全胚培养法获得的ESCs有一株目前已传至18代.山羊ESCs Nanong、Oct4、SSEA-3免疫组化染色呈阳性,SSEA-1免疫组化染色呈弱阳性,SSEA-4免疫组化染色呈阴性,RT-PCR检测显示其表达Nanog、Oct4、端粒酶、CD117.山羊ESCs经DMSO体外诱导可以向心肌细胞分化.这些试验均表明该细胞具有ESCs的生物学特性.