牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶和紫杉二烯合酶基因在灰盖鬼伞中的组合表达

紫杉二烯是紫杉醇合成途径中的前体物质。紫杉醇是红豆杉的一种重要的次级代谢产物,是一种重要的新型抗癌药物。然而,紫杉醇在植物中含量低且难提取,限制了高效应用。利用基因工程手段,借助担子菌类真菌灰盖鬼伞具有的内源类异戊二烯合成途径,构建含有牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate,GGPP)合酶和紫杉二烯合酶的融合基因表达载体p Bg GGTS和独立表达盒表达载体p Bg GGg TS,并分别转入灰盖鬼伞LT2菌株中,经过选择性筛选、PCR鉴定、Southern blotting杂交验证,分别获得了5株融合表达的灰盖鬼伞工程菌和5株独立表达盒的灰盖鬼伞工程菌株。各随机挑选了1株工程菌株,分别提取菌丝体和发酵液分析。GC-MS分析表明,两种工程菌株与原出发菌株的菌丝提取物无明显差异峰,而与出发菌株的发酵液提取物相比,两种转基因灰盖鬼伞的发酵液中均出现了明显的差异峰,采用GC-MS特征质量离子分析方法判定为紫杉二烯,分别为44 ng/L(转化p Bg GGg TS)和30 ng/L(转化p Bg GGTS)。结果表明,通过在灰盖鬼伞融合基因或各自独立表达的形式共表达ggpps和ts基因,可以生物合成紫杉二烯。     

乏氧诱导因子-1α基因沉默对肺癌细胞乏氧应答相关基因表达的影响

乏氧诱导因子-1α (HIF-1α)是肿瘤细胞适应乏氧微环境的关键调控因子,具有作为治疗靶基因的潜力,以克服乏氧诱导的治疗抗拒等效应.下调其表达可能影响肿瘤细胞内一系列乏氧应答相关基因的表达.本研究采用已构建的HIF-1α RNAi慢病毒载体转导肺腺癌A549细胞,经杀稻瘟素（blasticidin）筛选建立HIF-1α基因稳定沉默的A549细胞株.应用cDNA微阵列技术检测并比较HIF-1α基因沉默A549细胞株和其亲本细胞株在常氧和乏氧状态下的基因表达谱改变. 应用定量RT PCR方法验证部分cDNA芯片差异表达基因的表达改变.HIF-1α基因稳定沉默细胞株A549/HIF-1α,在常氧和乏氧条件下HIF-1αmRNA水平分别较A549细胞下降89.2％和88.1％,HIF-1α蛋白水平分别下降97.2％和88.4％. 在乏氧条件下,cDNA微阵列检测的1 280个基因中,52个基因表达上调,15个基因表达下调. HIF-1α基因沉默显著影响其中27个基因的乏氧诱导效应.定量RT-PCR验证其中ENO2、BCL-2、CXCR4和MMP11的表达水平,与cDNA芯片结果相符合.结果提示,HIF-1α基因沉默能够在一定程度上阻断肺癌细胞的乏氧应答,在克服乏氧导致的肺癌治疗抗拒方面具有潜力.     

银耳芽孢完整细胞高效转化体系的建立

银耳（Tremella fuciformis）属于高等担子菌,其担孢子芽殖产生酵母状分生孢子称为银耳芽孢．银耳芽孢单核,能像酵母那样快速生长且容易培养,具备优良外源基因表达宿主的特点．本研究以gpd—Gl启动子分别与绿色荧光蛋白基因gfp和潮霉素抗性基因hph连接构建表达载体pG1g—gfp和pG1q—hph;设置潮霉素浓度梯度在3种培养基中对银耳芽孢的敏感性进行测定,结果表明银耳芽孢在不同的培养基上对潮霉素的敏感性不同,在MA培养基上其最低敏感浓度为5μg／mL;采用电击法把pG1q—hph质粒转化进银耳芽孢完整细胞,假定转化子经MA筛选培养基筛选,结果表明银耳芽孢完整细胞电击转化的最佳参数为：STM电击缓冲液、银耳芽孢浓度1．0×10^8个／mL,电击体积200μL,表达质粒6μg,电击电压2．0kV／cm,电击后采用MB液体培养基静置预培养48h,转化率达277个／μg DNA．采用最佳电击参数把质粒pG1g—gfP和pG1g—hph按1：1共转化银耳芽孢,转化子经过筛选培养基筛选、PCR鉴定及Southern杂交验证,结果表明受鉴定的8个转化子中有3个整合了gfp基因,其共转化率为37．5％．这3个gfp基因转化子的芽孢在激光荧光显微镜下可观察到发出强烈的荧光,表明了外源gfp基因能够在银耳芽孢中获得高效率的表达．     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

香菇印gpd-Le和ras-Le启动子的功能分析

利用从香菇菌丝体中克隆的启动子片段gpd-Le(613bp)和ras-Le(715bp)分别连接于报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)的上游,构建了启动子功能活性检测表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pLg-gfp和pLr-gfp分别与辅助质粒pCc1001(含有trp1基因)共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测。结果表明:香菇gpd-Le启动子在灰盖鬼伞的菌丝中具有较强驱动外源gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察到gfp基因表达的绿色荧光。而香菇ras-Le启动子没有检测到有驱动外源gfp基因表达的活性。     

灰树花gpd-Gf启动子的功能分析

利用从灰树花菌丝体中克隆的gpd-Gf（615bp）启动子片段串联于报告基因gfp上游,构建启动子功能活性检测表达质粒pGg-gfp。采用PEG介导法把表达质粒pGg-gfp与辅助质粒pCc1001（含有trp1基因）共转化进色氨酸营养缺陷型的灰盖鬼伞粉孢子的原生质体中。经过选择培养基筛选、假定转化子的分子鉴定以及GFP荧光检测, 结果表明：灰树花gpd-Gf启动子在灰盖鬼伞菌丝中具有较强驱动gfp基因表达的活性,在荧光显微镜和共聚焦显微镜下可以观察到转化子菌丝发出的强烈荧光。     

慢病毒shRNA表达载体介导人肿瘤细胞基因稳定沉默的影响因素

目的 探讨慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰的影响因素。方法 以乏氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）和乏氧诱导因子-1β（Hypoxia-inducible factor-1β, HIF-1β）基因为靶基因,采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System生产表达靶基因shRNA的慢病毒载体,转导Hela、SPCA1和A549,采用定量RT-PCR技术检测靶基因mRNA表达水平。结果 用此系统生产慢病毒,每一10cm培养皿可收获6.3×1010个病毒颗粒。浓度为2×1010copies/ml的Lenti6-HIF1α和Lenti6-HIF1β转导SPCA1、A549和Hela细胞的功能滴度分别为：1.8×106TU/ml、1.2×106TU/ml、1.75×106TU/ml和1.76×106TU/ml、1.21×106TU/ml和1.79×106TU/ml。延长病毒的吸附时间可以提高转导效率, 8小时以内转导效率与吸附时间呈正比,12小时开始进入平台期。1/4、1/2、1、2、4、8倍MOI的Lenti6-HIF1α病毒转导SPCA1和Hela细胞48小时后,RNAi效果与病毒量呈正相比。用筛选的转导细胞证实,RNAi长期效果与细胞类型无关,但与shRNA表达结构整合到靶细胞基因组的拷贝数呈正相关。结论 慢病毒载体介导人肿瘤细胞RNA干扰,短期基因抑制效果取决于细胞类型、病毒量和病毒的吸附时间,稳定基因沉默效果与病毒整合到靶细胞基因组的拷贝数密切相关。