异源PDGF-A链表达对CHO细胞生长和转化的作用

用DNA磷酸钙盐沉淀方法把含人PDGF(血小板衍生生长因子)A链cDNA的表达质粒pSV_2neo-A转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),然后经G 418(400-800 μg/ml)筛选分离20个转染细胞株。选出其中At_1和Aot7细胞株所进行的实验结果表明,这些细胞的形态和生长行为均发生明显的变化,PDGF-A链mRNA的表达水平比CHO细胞明显增高,胞质有强阳性的PDGF荧光反应,显示有PDGF样蛋白的合成。这些细胞不但生长速率加快,有高密度持续生长的特性,而且能在软琼脂培基上形成大集落和在裸鼠体内接种形成纤维肉瘤,提示外源PDGF-A链基因的表达有使CHO细胞生长失控和发生细胞恶性转化的作用。     

肝癌细胞(AH_(66))甲胎蛋白基因结构的一些变化

对AFP基因重新表达的分子机制的研究,有助于了解癌变的本质。我们以AFPmRNA反转录合成的~3H-cDNA为探针,进行液相杂交;用RAF 65和RAF_(87)与体外染色质转录系统转录的~(32)P-RNA进行点杂交,测出移植性大鼠肝癌AH_(66)细胞核和离体染色质的AFP基因转录水平远远高于正常大鼠肝。以BamHI,EcoRI,HindⅢ和PstI酶解基因组DNA,然后与缺口翻译标记的~(32)P-RAF_(65)和~(32)P-RAF_(87)探针杂交,测知BamHI和EcoRI的酶谱相同,而HindⅢ和Pst I的带型明显不同,表明结构上存在某些变化。用HpaⅡ和MspI测定了AH_(66)和正常大鼠肝AFP基因的甲基化程度,结果表明,AH_(66)的AFP基因甲基化不足。AFP基因的染色质构型,由它对DNaseI的敏感性来测定,AH_(66)对DNaseI比正常大鼠肝更敏感,表明基因处于活性状态。所有这些结果表明,AH_(66)的AFP基因存在某些结构上的变化,这种变化对于AFP基因从掩盖到活性状态可能是重要的。     

大鼠白蛋白mRNA3'端顺序的分子克隆(简报)

白蛋白与甲胎蛋白基因是由同一祖先基因进化而来。在小鼠,它们是一前一后定位在同一条染色体DNA上。在个体发育和肝癌变过程中,这两基因的相互关系也呈现相反的表达水平。因此,研究甲胎蛋白基因表达的调控与白蛋白基因是不可分割的。本文简要报道我们克隆了大鼠白蛋白mRNA 3′端顺序,为研究白蛋白基因结构和表达提供了必要的探针。白蛋白mRNA是从Wistar大鼠肝脏用双抗体免疫沉淀法提取。分子克隆技术基本是按“分子克隆”实验手册进行。     

采用双抗体免疫沉淀技术分离和提纯大鼠肝细胞白蛋白mRNA

采用双抗体技术和Poly(U)-Sepha-rose 亲和层析法,分离和纯化出为均一的大鼠肝细胞白蛋白mRNA。把酸乙醇—硫酸铵分部和Sephadex G-150柱层析得到均一的大鼠血清白蛋白,免疫家兔得到抗血清,上白蛋白-Sepharose 柱,得到了纯的抗白蛋白抗体。用它与肝聚核糖体一起温育,得到合成白蛋白的聚核糖体。它们之间的结合是高度专一的,似乎是通过核糖体上的初生白蛋白多肽的免疫识别作用所致。反应的免疫复合物用第二抗体追踪,然后把聚核糖体—第一抗体—第二抗体复合物,通过一个不连续的蔗糖梯度,除去未反应的聚核糖体和抗体。用苯酚—氯仿—异戊醇(50∶48∶2)从免疫沉淀中分离出白蛋白聚核糖体RNA,上poly(U)-Sepharose 柱,得到大鼠肝细胞白蛋白mRNA。所分离白蛋白mRNA,在2%聚丙烯酰胺—0.5%琼脂糖凝胶电泳时为一条带。在依赖于mRNA 的麦胚无细胞蛋白合成系统中,所有的翻译产物由第一抗体识别,第二抗体追踪,用凝胶电泳法鉴定为真正的白蛋白——约有70—80%新生白蛋白多肽与天然白蛋白一起移动。麦胚抽提物的翻译分析表明,提纯的白蛋白mRNA 的活力可高达白蛋白pRNA 的53倍。     

杂交水稻及其亲本幼苗的乙醇酸氧化酶与细胞色素氧化酶活性的研究(简报)

籼型杂交水稻不育系的乙醇酸氧化酶和细胞色素氧化酶比活差异较小,而恢复系之间则较明显,杂种优势越强的杂交种(F_1),其乙醇酸氧化酶的比活性越低,细胞色素氧化酶d值(杂种与父母本平均值之差)与乙醇酸氧化酶活性的d值总的变化趋势一致。F_1代的盐溶性蛋白质含量高于亲本。     

外源血小板衍生生长因子(PDGF)B链基因在CHO细胞的表达

本文总结应用DNA-磷酸钙盐沉淀的基因转移技术,把含人c-sis cDNA的质粒pSM-1,以单独转染或与pSV_2neo共转染方法转入CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),经低血清或G_(418)筛选分离得到多个有PDGF表达的细胞株。其中PDGF高表达件——FB_6,细胞形态和生长行为明显改变,可在软琼脂培基上形成集落,细胞生长速率加快,能在低血清(2%)培液中长期传代,细胞的条件培液有刺激静止的NRK细胞(大鼠肾成纤维细胞)DNA合成的活力。RNA点杂交和Southern Blot显示FB_5细胞有??PDGF mRNA的高表达和人c-sis基因的整合,而且,在连续传代7个月后,FB_5细胞基因组中仍然有人c-sis基因存在,说明CHO细胞的不正常生长和转化是由于PDGF基因的稳定整合和高表达所引起。这一稳定转化株(FB_5)是进一步研究PDGF对细胞生长控制和转化功能的理想模型。     

大鼠肝癌(BERH-2)细胞甲胎蛋白信使核糖核酸的分离与提纯

采用双抗体免疫沉淀合成AFP的聚核糖体并合Poly(U)-Sepharose亲和层析的方法分离和提纯了大鼠肝癌BERH-2细胞的AFPmRNA。这种纯的AFPmRNA在2％聚丙烯酰胺—0.5％琼脂糖凝胶中以单一的22S带移动。用双抗体免疫沉淀的方法,鉴定麦胚抽提液中由AFPmRNA直接合成的蛋白。在纯甲胎抗体所沉淀的多肽中,有95％的放射性在凝胶电泳中与载体AFP一起移动。在最佳条件下,AFPmRNA在麦胚系统中翻译产物比AFPpRNA高54倍。用AMV反转录酶合成互补于AFP-mRNA的DNA(AFP~3H-cDNA),用分析AFP-mRNA.AFP~3H-cDNA杂化物的热变性来测定AFPcDNA的真实性。高达89℃的Tm值,表明所反转录的cDNA是AFP-mRNA真实的拷贝。     

大鼠肝癌甲胎蛋白mRNA在麦胚蛋白合成系统中的翻译(简报)

在肝细胞的癌变过程中,甲脂蛋白(AFP)基因发生了去封闭的改变;因此,甲胎蛋白是研究肝癌细胞基因表达调节很好的指征。本文简要报道从本所建株的AFP阳性的大鼠移植性肝癌(BERH-2)(强家模等,1978)抽提信息核糖核酸(mRNA),在麦胚无细胞蛋白合成系统中翻译出AFP。肝癌mRNA的抽提是按稍加改变的Nakanishi等(1977)方法进行的。先抽提肝癌胞质总RNA,检定A260/A230>2,A280/A260<0.5;然后按Aviv和Leder(1972)法进行了寡聚(dT)-纤维素层析。检定提取到     

红细胞血影介导7sRNA对大鼠肝癌细胞(CBRH-7919)DNA复制、转录和甲胎蛋白合成的影响

本文总结了用红细胞血影介导正常肝7sRNA进入肝癌细胞的定位及其对细胞DNA复制、转录和蛋白合成的影响。装载~(125)I-78RNA的血影与肝癌细胞融合后,放射自显影标本显示7sRNA在细胞内的分布,主要定位于细胞质,也有见于细胞核内。7sRNA进入细胞后对细胞的DNA复制、转录和蛋白合成有抑制作用。免疫荧光和免疫沉淀法检测肝癌细胞甲胎蛋白合成的结果表明,7sRNA导入晚G_1期同步细胞后继续培养4小时,甲胎蛋白合成减少。由于细胞DNA复制和转录被抑制,在一定程度上影响了甲胎蛋白基因的表达。     

7SRNA在癌细胞中含量改变及其对染色质转录活性的调节

7s RNA与哺乳动物基因组中有300,000重复拷贝的Alu DNA顺序高度互补。Alu DNA的功能是与结构基因的转座和表达调控密切有关。因此7s RNA对基因表达可能有调节作用。本文提供实验:1.肝癌细胞核内7s RNA含量比正常核少,意味着减弱了对癌细胞基因表达的控制。2.7s RNA比其他的核小分子量RNA更紧密与染色质结合。3.7sRNA对离体染色质的转录活性有促进和抑制的两相作用,这些结果直接和间接表明7s RNA对基因表达起一定的调节作用。由于Alu DNA在基因组中分布是广泛性的,因此认为7s RNA的调控作用也应是一般控制性质的。