植物甜蛋白马宾灵(Mabinlin Ⅱ)的二级结构及其B细胞抗原表位预测

马宾灵(MabinlinⅡ)是中国所特有的植物甜蛋白,在目前已知的7种植物甜蛋白中具有最佳的热稳定性,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。本研究以马宾灵的氨基酸序列为基础,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法预测马宾灵的二级结构,采用Karplus-Schulz方法预测马宾灵的蛋白质骨架区柔韧性,采用Kyte-Doolittle方法预测马宾灵的蛋白质疏水性,采用Emini方法预测马宾灵的蛋白质表面可能性,采用Jameson-Wolf方法预测马宾灵的B细胞抗原表位。分析结果表明,马宾灵的A链多形成转角和无规则卷曲结构,A链的N端27～30区段形成较柔软的蛋白质骨架结构,A链的N端4～6、7～9、10～11、12～14、20～22、23～26和30～33区段为抗原位点的可能性较大;马宾灵的B链多形成β折叠和转角结构,B链的N端0～7、9～13、28～29、33～34、40～45、53～54和55～57区段为抗原位点的可能性较大。本研究以生物信息学手段分析预测马宾灵的二级结构及其B细胞抗原表位,为设计马宾灵多克隆抗体以检测马宾灵在不同生物反应器中的表达研究提供参考数据。     

紫外诱变筛选海洋红酵母S8的尿嘧啶缺陷型菌株

本课题组从海南天然海域筛选到一株高产类胡萝卜素的海洋红酵母菌株S8,该菌株对鱼无毒害,并与鱼共生,欲将其应用于盐诱导表达外源蛋白的海洋红酵母工程菌的构建。本研究利用紫外诱变筛选的方法处理S8菌株,通过统计其UV致死率、5-氟乳清酸致死率等筛选S8的尿嘧啶营养缺陷型突变株。研究结果表明,供试菌株通过紫外线诱变、5-氟乳清酸致死和回复突变率的实验筛选,共获得16株稳定的尿嘧啶缺陷型突变株,突变菌株在基本培养基中培养了8d仍不能生长。选择了其中的一株ST5进行了产胡萝卜素能力的测定,结果表明,在同样的培养条件下,野生型S8菌株细胞生物产量可达87.55g/L,类胡萝卜素含量可达520μg/g,突变株ST5的细胞生物产量为85.45g/L,类胡萝卜素含量为512μg/g;ST5的产胡萝卜素能力方面与野生型S8无明显差异。因此,尿嘧啶缺陷型菌株ST5可为下一步海洋红酵母工程菌的构建提供受体菌。     

一株拮抗香蕉枯萎病的内生细菌的分离及其几丁质酶基因信号肽的分泌活性分析

目的：旨在分离并选择一株香蕉内生细菌作为内生基因工程生防菌,并克隆其几丁质酶基因的信号肽序列。方法：从香蕉植株杆下部分离并选择了一株拮抗香蕉枯萎病且具有分泌几丁质酶能力的内生细菌,对该菌株进行了形态观察、生理生化测定和16S rDNA序列分析,克隆了其几丁质酶基因的编码序列并预测了其信号肽,构建了含有信号肽和不含信号肽的几丁质酶的表达菌株BL-chi1和BL-chi2。结果：结合形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列比对分析确定该菌株为Klebsiella属,将该菌株命名为KKWB 5;BL-chi1和BL-chi2经IPTG诱导后,均表达了与预期蛋白大小一致的蛋白,同时BL-chi1诱导后的培养基上清中出现一条约45kDa的条带,而BL-chi2和空载体的BL-pET22b诱导后的培养基上清中均无此条带;几丁质水解试验发现,BL-chi1诱导后的培养基上清中的蛋白经浓缩和纯化后都能在几丁质平板上形成透明水解圈。结论：该几丁质酶的信号肽能被BL21（DE3）所识别,将几丁质酶分泌到培养基中,并且分泌的几丁质酶具有水解几丁质的生物学活性。内生菌KKWB-5的分离及其几丁质酶分泌信号肽序列的克隆为进一步构建内生工程菌来防治香蕉枯萎病打下了基础。     

重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

Mabinlin Ⅱ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白,在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物.本文根据已知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆Mabinlin Ⅱ基因,对基因进行剪切重组.将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,构建了3个重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌.经IPTG诱导,3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5强启动子片段的分离及鉴定

目的:旨在获得香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5的强启动子片段,以应用于香蕉内生工程菌的构建。方法: 利用以kan^r基因为报告基因的启动子探针载体pUCK在大肠杆菌Top10中克隆KKWB-5基因组DNA 的启动子片段;将筛选到的高抗Kan的质粒导入KKWB-5,分别于LB和香蕉杆浸汁培养基(BSM)平板上检测它们的抗Kan水平;选择在BSM上抗Kan水平最高的片段15,检测该片段的基因间隔区15P的启动子活性,最后以gfp为报告基因来验证片段15P的启动子活性。结果:有7个抗Kan 水平在2500μg/ml以上的Top10转化子;这7个质粒在导入KKWB-5后,它们在LB平板上的抗Kan 水平有不同程度的增加,但在BSM培养基上则大为减弱;片段15P具有启动kan^r 基因的活性,且与原片段15的抗Kan 水平相同;重组质粒pUCK-6-15Pgfp,以Top10和KKWB-5为宿主菌,在LB培养基上培养时,在荧光显微镜下均能发出绿色荧光;以KKWB-5为宿主菌,在BSM培养基上培养时,在荧光显微镜下也能发出绿色荧光。 结论:片段15不仅在Top10中具有较强的启动子活性,而且在其供体菌KKWB-5中具有更强的启动子活性,其基因间隔区15P为主要的启动子区域,在BSM培养基上也具有较好的启动子活性,该启动子片段15P可以应用于KKWB-5内生工程菌的构建。     

免疫层析试纸条技术及其在转基因检测中的应用

转基因检测是转基因生物安全监管的重要环节。目前需要一种适合于大规模筛查的快速检测转基因成分的方法,以扩大转基因生物安全的监测范围。免疫层析试纸条是一种快速免疫分析技术,是目前常用的快速检测方法之一,具有操作简单、样品量少、检测快速、成本低等优点,已在医学、食品和环境等多个领域广泛应用。介绍了免疫层析试纸条的组成结构、检测原理及免疫标记物,并总结了其在转基因检测方面的研究进展。