CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除胰岛β细胞PKA C-α的研究

利用CRISPR/cas9系统建立稳定敲除PKA C-α基因的INS-1细胞株,研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能。设计2个长25 bp且分别靶向PKA C-α基因的exon 5和exon 7的sgRNA,将其克隆至LentiCRISPRv2-sgRNA质粒并转染至293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒感染INS-1细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并采用有限稀释法筛选单克隆细胞,Western blotting印记法检测单克隆细胞中PKA C-α蛋白的表达水平,测序确认单克隆细胞中PKA C-α基因的突变位点。WB实验证实靶向Exon 5的sgRNA可成功敲除PKA C-α基因,得到稳定敲除PKA C-α基因的细胞株,测序结果表明该细胞株的PKA C-α基因发生1 bp碱基插入突变,并且敲除PKA C-α基因的INS-1细胞胰岛素分泌能力下降。本实验利用CRISPR/Cas9系统成功敲除INS-1细胞中的PKA C-α基因,为研究PKA C-α在胰岛β细胞中的功能奠定了基础。     

Homer-1a蛋白在异氟烷预处理脑保护中的作用

目的：探讨Homer-1a蛋白在异氟烷（Iso）预处理脑保护中的作用。方法：60只雄性SD大鼠（250~270g）,随机分为三组：Sham组（n=20）,仅分离血管不留置线栓;IR组（n=20）采用线栓法栓塞大脑中动脉致局灶性脑缺血模型,2h再灌注;IP组（n=20）,接受1h的异氟烷预处理（2％异氟烷,98％氧）,预处理后24h制作Mcao模型,分别于24h、48h、72h、7天后观察动物神经行为学改变。用Westernblot于24h、48h、72h、7天后对Homer-1a蛋白表达量进行分析。结果：24h时,IR组Homer-1a蛋白表达量低于Sham组（P〈0．05）．IP组Homer—1a蛋白表达量明显高于Sham组（P〈0．01）,IP组Homer-1a蛋白表达量高于IR组（P〈0．05）;48h时,IP组Homer．1a蛋白表达量高于Sham组（P〈0．05）,IR组Home〉1a蛋白表达量低于Sham组,IP组Home-1a蛋白表达量与IR组没有统计学意义;72h时,Sham组与IR组、IP组之间均无统计学意义;7天时,Sham组与IR组、IP组之间均无统计学意义。结论：在局灶性脑缺血中异氟烷预处理提高了Home-1a蛋白表达。     

连作土壤中施加球毛壳ND35菌肥对杨树生理特性的影响

在山东农业大学林学实验站杨树连作土壤中施加不同剂量(0.17、0.33、0.67、1.00、1.33和1.67 g·kg^-1)的球毛壳ND35菌肥,测定不同处理下一年生杨树叶片的光响应过程、叶绿素荧光以及叶黄素循环等光合生理生化指标,研究球毛壳ND35菌肥对杨树根系和光合生理性能的影响.结果表明: 随连作土壤中菌肥含量的增加,杨树叶片的叶绿素含量(Chl)呈增加趋势,电子传递速率(ETR)、净光合速率(P_n)、量子效率(Φ)、硝酸还原酶(NR)活性以及根系活力等生理指标均呈先增加后降低的趋势,依赖于叶黄素循环的光合热耗散呈降低趋势,而非光化学淬灭(NPQ)呈先降低后增加的趋势.在土壤施加菌肥剂量0.67和1.00 g·kg^-1处理时,光合机构的过剩光能减少,向光化学反应方向分配的光能增多,光能利用效率提高.在连作土壤中施加适量(0.67～1.00 g·kg^-1)的球毛壳ND35菌肥,能在一定程度上提高杨树的根系生理活性,提高杨树叶片对光能的利用效率,有利于改善杨树叶片的光合机构运转状态,提高叶片的光合作用效率.     

改良手工显微切割法获取特定细胞提取高质量RNA

探讨显微切割过程中有效保持RNA完整性的组织固定方法,建立一种简易的手工显微切割法.应用自制“T形板”辅助冰冻切片,100％无水乙醇一次性脱水固定,“排除切割法”获取目的细胞,用TRIzol提取RNA,琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR分析RNA质量.“一步法”固定可长时间保存RNA的完整性;从食管癌标本5个特定阶段的细胞中提取的RNA,经电泳和RT-PCR分析均具有较高的质量.无水乙醇“一步法”固定,在显微切割的过程中可有效保持RNA的完整性;T形板和“排除切割法”简化了手工显微切割的操作,提取的RNA质、量均可满足后续分子水平研究的需要.     

乳腺癌特异性基因1(BCSG1)异常表达的调控机制

从乳腺癌cDNA文库中分离出的乳腺癌特异性基因1(BCSG1, breast cancer-specific gene 1) 又称Synuclein γ, 其表达蛋白广泛分布在神经系统的神经元突触前末稍. 除神经系统外, 正常乳腺组织或良性病变中BCSG1几乎不表达, 而多数浸润性乳腺癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达异常增高. BCSG1的异常表达与肿瘤细胞的生长、浸润及转移相关. 为了解BCSG1的转录调控机制及转录因子对调控的影响, 用含启动子的BCSG1片段构建了不同长度的3¢端缺失片段、删除Sp1片段以及突变转录激活蛋白1(AP1, activator protein)位点的BCSG1启动子报告质粒, 并选用乳腺癌细胞系进行瞬时转染, 分析BCSG1启动子活性变化. 研究发现, BCSG1启动子5¢端区序列可决定BCSG1的基础转录活性, 并受Sp1位点调控; 在BCSG1蛋白阴性的乳腺癌细胞中, pGL3-1553的活性显著降低; 在HepG2肝癌细胞中, pGL3-1759的活性显著降低; 内含子1中AP1位点突变或缺失使启动子转录活性明显降低; c-jun和c-fos, 及cAMP效应器结合蛋白(CREB, cyclin AMP-responsive element binding)可以显著增强BCSG1启动子的活性. 这些结果表明, BCSG1的异常表达可能受多种因素影响, 5¢端区序列及Sp1位点决定BCSG1启动子的基础活性; 外显子1中含有可能影响BCSG1异常表达的关键序列; 决定细胞特异性表达的序列可能存在于内含子1中; 内含子中AP1结合位点可以调控BCSG1启动子的活性.     

大豆蛋白、苹果果胶及维生素C 排铅效果的探究

通过对铅中毒小鼠灌胃三种不同剂量的食物材料,探究大豆蛋白、苹果果胶及维生素C的排铅效果。实验通过每日对铅中毒小鼠喂食高、中、低三种不同剂量的苹果果胶、大豆蛋白和维生素C,连续28 d。然后收集小鼠的血液、肝脏和股骨,用原子吸收光谱仪进行铅检测。结果表明重金属铅的摄入会影响小鼠的健康和生长状况;大豆蛋白、苹果果胶和维生素C均具有一定的排铅效果,在最佳的条件下,血铅含量降低了65%~70%,肝脏铅含量下降了63%~85%,股骨铅含量下降了18%~26%。本实验证明大豆蛋白、苹果果胶及维生素C三种食品材料具有较好的降血铅效果,维生素C被认为是最适合用于开发排铅功能食品的原料。本研究为排铅功能食品的研发提供了重要的理论依据。