不同牛分枝杆菌特异性基因PCR方法的比较

【背景】牛结核病是我国二类动物疫病,世界动物卫生组织将其列为法定报告的动物疫病。牛主要通过患病牛呼吸道分泌物和咳嗽所产生的气溶胶感染;人则主要通过食用未经高温处理的病牛的肉或奶感染。因此,经过病原学PCR检测对疑似患病牛牛奶或屠宰组织样品进行快速检验确诊,能够最大限度地减少奶牛养殖中乳品生产业的经济损失。【目的】研究并确定适宜的牛分枝杆菌PCR扩增引物及参数,为临床快速准确诊断牛结核病提供参考。【方法】对已报道的5对PCR引物,运用降落(touch down) PCR法确定适宜退火温度(Tm);运用梯度稀释的牛分枝杆菌C68001株(国内牛结核菌素生产用菌株)基因组DNA以及不同菌液含量的人工模拟临床样本(淋巴结、肺脏和牛奶),确定不同引物PCR方法的敏感性;同时以6种常见牛感染菌(牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌Rev.1、牛分枝杆菌C68001和AN5、禽分枝杆菌C68202、副结核分枝杆菌C68681和胞内分枝杆菌C68226)核酸样本,确定不同引物PCR方法的特异性。【结果】所有引物在53-63℃均含有目的条带,确定引物的最佳退火温度是60℃。在细菌核酸敏感性检验中,1号和3号引物的检测敏感性最高,达10-10 ng/μL;其次是2号和5号,达10-5 ng/μL。对于人工模拟感染样本,1号、3号和4号引物在淋巴结和肺脏中检测敏感性最高,其次是2号;而2号、3号、4号和5号引物对奶样检测敏感性最高。对于特异性检验,2号和5号引物特异性较好,可检测到明显的牛分枝杆菌特异性条带,对通常不引起牛结核病而只干扰免疫学诊断的禽分枝杆菌检测条带较微弱,而布鲁氏菌、副结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌均无检测条带。【结论】2号引物及其反应参数的PCR方法敏感性、特异性良好,适合用于牛结核病的快速准确诊断。     

16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新,针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物,包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因扩增引物,以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project,EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度,而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外,最近有研究对这些通用引物进行了一些改进,而我们也发现,一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化,简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种,但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导,但在关注具体科学问题时,引物的选择仍需数据指导与实验尝试。     

亲土苔蛾成虫复眼超微结构

【目的】重叠型眼在昆虫复眼演化中起着重要作用。本研究旨在阐明夜出型亲土苔蛾Manulea affineola复眼类型及结构特征,以期填补灯蛾亚科昆虫复眼研究的空白,扩充夜出型昆虫复眼的特征数据,为探讨重叠型眼的变异趋势及复眼演化提供依据。【方法】运用光学和透射电子显微技术观察亲土苔蛾成虫复眼的超微结构。【结果】亲土苔蛾成虫复眼具有一个透明区,由6个次级色素细胞的透明胞质构成。小眼具8个视网膜细胞,其中1个视网膜细胞较短,仅位于小眼基部。在透明区内,7个视网膜细胞聚集成一束,其远端与晶体束末端相接,但并不形成视杆。在透明区下方,这7个视网膜细胞形成一个中心融合的视杆。在复眼背缘区的小眼的视杆具有近似矩形的横截面,而其余小眼的视杆具多分支状截面。【结论】亲土苔蛾成虫复眼属于重叠型眼;复眼背缘区的矩形视杆很可能与昆虫的偏振敏感性有关。     

番茄果实成熟过程中番茄红素含量及合成相关基因表达的分析

以2个高代自交系粉果番茄MLK1和红果番茄FL1为材料,利用实时荧光定量PCR技术及色差仪法,对果实成熟过程中4个时期的番茄红素含量分析及八氢番茄红素合成酶(Psy1和Psy2)和番茄红素环化酶(Lcy)基因的表达进行研究。结果表明,在番茄果实成熟的过程中,番茄红素的含量也逐渐增高,在完熟期达到最高,且红果中的含量高于粉果中的。在2个番茄品种果实不同部位中,Psy1、Psy2和Lcy基因在果实逐渐成熟的过程中转录水平均逐渐增加,在完熟期表达量最高,且红果FL1中的表达量高于粉果MLK1表达量,果实中Psy基因的表达量高于Lcy基因的表达量。     

二斑叶螨抗螺螨酯品系GST基因的克隆与表达分析

【目的】揭示二斑叶螨Tetranychus urticae对螺螨酯的分子抗性机理。【方法】利用RT-PCR克隆了二斑叶螨的谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase, GST)基因 cDNA 全长序列, 采用生物信息学软件分析了克隆基因的编码蛋白特性; 利用实时荧光定量PCR 方法分析GST基因在二斑叶螨的螺螨酯抗性与敏感品系中的表达差异。【结果】克隆获得的谷胱甘肽-S-转移酶2个基因分别被命名为TuGSTd1和TuGSTd2 (GenBank登录号分别为： KC445659和KC445660)。序列分析发现, TuGSTd1的开放阅读框长度为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.47 kDa, 理论等电点为5.49; TuGSTd2的开放阅读框为648 bp, 编码215个氨基酸, 分子量约为24.57 kDa, 理论等电点为6.33。系统发育分析表明这两个基因与桔全爪螨Panonychus citri Delta家族的GST基因的氨基酸序列一致性为93%。实时荧光定量PCR 结果表明, TuGSTd1和TuGSTd2在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量分别为敏感品系的5.60和3.75 倍。【结论】 GST基因在二斑叶螨抗螺螨酯品系中的相对表达量均显著高于敏感品系, 据此推测GST基因的过量表达可能与其对螺螨酯的抗性形成有关。     

基于EMA-qPCR的茄科青枯菌活体检测技术的建立

【目的】利用特异性核酸染料叠氮溴乙锭(Ethidium monoazide bromide, EMA)与实时荧光定量PCR技术相结合, 建立一种能有效区分青枯菌死活细胞的检测方法。【方法】样品DNA制备前经EMA渗透预处理, 再进行实时荧光定量PCR特异扩增菌体DNA。【结果】终浓度为2.0 mg/L的EMA能有效排除1.0×107 CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增, 对活细胞和不可培养状态(Viable but non-culturable, VBNC)活菌的DNA扩增均没有影响。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×100?5.0×104 CFU范围内时, 扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性(R2=0.992 5)。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现, 待检样品可在24 °C与4 °C冷藏条件下短期保存。【结论】本研究建立的EMA-qPCR方法能有效检测青枯菌VBNC细胞和有效区分死活菌, 避免或减少青枯菌PCR检测的假阳性和假阴性。     

钝齿棒杆菌argR基因缺失株构建及其缺失对精氨酸生物合成途径相关基因转录水平的影响

[目的]钝齿棒杆菌AS 1.542中argR基因编码的蛋白ArgR在精氨酸生物合成途径中扮演负调控的角色,但其对相关基因在转录水平的影响还未见报道.因此,本课题组构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并在转录水平上比较野生株与缺失株精氨酸生物合成途径相关基因的变化.[方法]采用无痕敲除的方法构建了钝齿棒杆菌argR基因缺失株,并采用荧光定量PCR方法分析缺失株和野生株精氨酸生物合成途径相关基因在转录水平的变化.[结果]利用pK18mobsacB质粒中蔗糖致死基因sacB反向筛选标记及PCR方法成功筛选到钝齿棒杆菌argR基因缺失株;荧光定量PCR结果表明,argR基因缺失株精氨酸生物合成途径中相关基因在转录水平获得大量提高,平均约上调162.13倍.[结论]钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径的相关基因受负调控蛋白ArgR的显著调控,但其基因的敲除并没有引起精氨酸产量发生明显的变化.     

新疆额尔齐斯河流域冷水鱼肠道耐低温乳酸菌的分离筛选及其遗传差异

[目的]从新疆阿勒泰地区额尔齐斯河流域冷水鱼肠道中分离耐低温的乳酸菌,挖掘乳酸菌的物种和遗传多样性,为低温乳酸菌生物技术研发提供优良菌种.[方法]利用MRS、Elliker两种不同培养基从9种冷水鱼肠道中,分离筛选出耐低温菌,测定细菌最适生长温度并进行常规生理生化实验.根据16S rRNA基因序列初步确定耐低温菌的系统进化地位,并采用BOX、(GTG)5、ERIC三种不同的引物进行rep-PCR,对16S rRNA基因高度同源性的菌株进一步区分.[结果]分离得到78株耐冷菌,最终确定有24株为耐低温乳酸菌,菌株的最适生长温度在15-24℃之间.系统发育分析结果表明:24株耐低温乳酸菌隶属于6个属,其中肉杆菌属(Carnobacterium)3株,乳球菌属(Lactococcus)9株,肠球菌属(Enterococcus)7株,环丝菌属(Brochothrix)1株,魏斯氏菌属(Weissella)2株,链球菌属(Streptococcus)2株.指纹图谱聚类分析树状图显示乳球菌属(Lactococcus)和肠球菌属(Enterococcus)存在种及菌株水平上的遗传差异,前者包括4个种,后者2个种.[结论]新疆额尔齐斯河流域冷水鱼肠道中分离的耐低温乳酸菌以球菌为主,没分离到常见的乳杆菌,需进一步完善分离培养的方法,深入挖掘和研究其物种多样性和遗传多样性.     

基于宏基因组学的猪群样本病毒探测方法的建立

极其多样的病毒广泛存在于我们周围的环境和动物体内,其中很多病毒是人类所未知的,而发现未知病毒常常受制于病毒常规检测技术的局限性.[目的]构建未知病毒检测技术平台.[方法]应用病毒宏基因组学的理念,结合新型分子诊断技术,首先利用过滤和核酸酶处理去除样品宿主核酸干扰,然后随机PCR扩增潜在的病毒宏基因组,最后通过大规模测序及序列分析获取病毒核酸信息.[结果]利用此技术我们对猪瘟病毒(CSFV)细胞培养物和猪圆环病毒2型(PCV2)感染猪病料进行了分析,分别检测到序列总长度1680 bp,占基因组13.7％的CSFV序列和序列总长度834 bp,占基因组47.2％的PCV2序列;利用此检测技术平台研究一未知病原细胞培养物,通过测序和序列分析,结果显示56条序列中有26条为副流感病毒5型(PIV5)同源序列,覆盖了其基因组全长的16.4％;此外,应用本研究建立的方法结合新一代高通量测序,我们在混合的7份病原未知的病猪组织样品中检测到了1.1％的病毒序列,包括CSFV、PCV2、猪细环病毒(TTSuV)、猪bocavirus (PBoV)和人腺病毒6型(Ad6)等的部分基因序列.[结论]本研究建立的基于病毒宏基因组学的未知病毒的检测方法突破了传统病毒研究方法的缺陷,对于猪群样本中病毒的检测具有较高的敏感性,有望为新发、突发感染性疾病的诊断和监测提供技术支持.     

TaqMan-MGB探针检测文森巴尔通体博格霍夫亚种实时荧光定量PCR方法的建立及应用

【目的】应用TaqMan-MGB探针技术,建立具有种水平特异性、高敏感性的荧光定量PCR方法,用于快速检测文森巴尔通体博格霍夫亚种。【方法】在序列特异性扩增区标记(Sequence characterized amplifiedregion,SCAR)技术基础上,依据文森巴尔通体博格霍夫亚种一段特有的基因序列设计探针和引物,分别优化扩增反应的退火温度、探针和引物的反应浓度;分析此方法的特异性、敏感性及重复性;绘制标准曲线,评估PCR反应的扩增效率和稳定性。【结果】本研究设计的TaqMan-MGB探针具有种水平特异性;最低检出限为每个PCR反应11个拷贝;组内和组间的变异系数CV值分别为0.12%-0.70%和0.14%-0.55%,在允许范围内;标准曲线线性关系良好(R2=1),扩增效率高(E=104.7%)。【结论】本研究建立的基于TaqMan-MGB探针技术的荧光定量PCR方法能够在种水平特异性、高灵敏度检出文森巴尔通体博格霍夫亚种,为这种巴尔通体所引起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。