两广地区家蚕白僵菌的SSRs遗传多样性

为查明广东和广西地区家蚕Bombyx mori病原白僵菌的来源及其菌株间的相互关系, 本研究利用了微卫星标记（simple sequence repeats, SSRs）技术, 分别对采自广东、 广西蚕区的白僵菌菌株居群之间和居群之内的遗传多态性进行了研究。结果发现, 两广白僵菌居群之间的基因分化系数（Gst）是0.0590, 多态位点百分率（PPL）为97.73%, Nei氏基因多样性指数（H）为0.1896, Shannon氏信息多样性指数（I）为0.3165, 表明两广家蚕来源的白僵菌居群间的遗传分化较小; 两个居群内部的遗传多态性研究结果分别是广东白僵菌居群的PPL=68.18%, H=0.1910, I=0.3044, 而广西白僵菌居群的PPL=65.91%, H=0.1713, I=0.1791, 表明广东白僵菌居群的遗传多样性水平较高, 广西白僵菌居群遗传多样性水平相对较低。最后, 利用Nei氏遗传距离进行了两广地区白僵菌菌株间地理来源关系的聚类分析, 结果表明实验室保存菌株单独聚为类群Ⅰ, 而不同采集地的菌株聚为类群Ⅱ。结果反映了生产来源的白僵菌菌株存在遗传多态性和基因分化现象, 暗示了家蚕白僵病病原来源的复杂性, 还说明应用SSRs技术进行家蚕白僵病病原的溯源是一条可行的途径。     

球孢白僵菌不同感染方式侵染棉铃虫幼虫的毒性比较及组织病理变化

为明确球孢白僵菌在不同感染方式下对棉铃虫的侵染能力, 采用饲喂法和浸渍法测定了球孢白僵菌HFW-05对棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner) 2龄幼虫的致病力, 并通过组织切片显微技术、 扫描电镜技术观察了球孢白僵菌HFW-05对棉铃虫的致病方式。结果表明: 白僵菌HFW-05可通过消化道（饲喂法）成功侵染2龄棉铃虫, 接种感染6 d后的校正死亡率为75.8%。经由体表（浸渍法）接种白僵菌HFW-05的试虫, 试验中体重的变化和取食量与对照相近（6 d校正死亡率仅为17.3%, 不能通过体表达到致病效果）。组织病理学变化表明: 26±1℃条件下, HFW-05菌株对棉铃虫以消化道侵染为主, 侵染后可导致寄主中肠微绒毛脱落严重, 肠壁组织溶解并最终只剩余底膜; 马氏管变形萎缩, 边缘向外突出隆起, 管径变大; 脂肪体萎缩解体, 结构松散; 表皮下的细胞被菌丝侵染破坏。浸渍法接种的试虫, 切片观察处理6 d后试虫, 体内未发现菌丝, 肠壁组织正常完整。扫描电镜观察, 浸渍法接种的分生孢子未能穿透棉铃虫表皮, 而是贴于寄主表皮表面生长, 在湿度合适的条件下, 菌丝生长到一定时间后断裂成为芽生孢子。白僵菌HFW-05可经由消化道对棉铃虫达到较高的致病效果, 在一定程度上弥补外界环境对白僵菌侵染的不利影响, 对今后应用白僵菌进行生物防治具有重要意义。     

球孢白僵菌中聚酮合酶基因多样性分析

本研究利用基因挖掘技术从球孢白僵菌(Beauveria bassiana)基因组中获得聚酮合酶(PKS)基因,并对这些基因序列进行生物信息学分析预测其功能,同时检测这些基因在不同培养基培养条件下的表达情况。结果显示:球孢白僵菌中含有13个PKS(Bdass1~13)基因,结构域分析显示球孢白僵菌中有还原型PKS 8个,非还原型PKS 2个,杂合型NRPS/PKS 3个;聚类分析显示Bdass8参与卵孢白僵菌素生物合成,Bdass5可能参与洛伐他汀九酮体的生物合成、Bdass4可能参与伏马菌素的生物合成、Bdass11可能参与phenolthiocerol的生物合成;非还原型PKS中Bdass7和Bdass10可能参与分生孢子色素的合成,Bdass1、Bdass2、Bdass3、Bdass6、Bdass9、Bdass12、Bdass13分别与其他未知聚酮合酶形成独立的分支;不同的PKS基因在不同培养基培养条件下其表达情况差异非常显著,如Bdass8、Bdass10和Bdass11在5种培养基上均强烈表达,Bdass4、Bdass6在5种培养基上微弱表达,Bdass1、Bdass5、Bdass11、Bdass12、Bdass13仅在几种培养基上表达,Bdass2仅在INO培养上微弱表达,Bdass3、Bdass7在5种培养基上均不表达。该研究为球孢白僵菌中PKS基因的功能鉴定奠定基础。     

NirA1基因对球孢白僵菌生长、抗逆及毒力的影响

[目的] 探究参与硝酸盐同化的一个特异转录因子NirA1对球孢白僵菌（Beauveria bassiana）生长、抗逆及毒力的影响。[方法] 利用RT-PCR检测球孢白僵菌NirA1基因在不同培养基中的表达特征。通过构建敲除突变株ΔNirA1、超量表达OENirA1及回复互补菌株ComNirA1,解析NirA1在球孢白僵菌生长发育、逆境胁迫反应和致病昆虫中的功能。[结果] NirA1基因在营养较贫瘠的CZB培养基中表达量高于丰富培养基PDB和SDB。敲除NirA1导致了菌株在人工培养基上的生长缓慢,对NaNO₂和Urea的利用效率降低。RT-PCR显示,ΔNirA1中硝酸盐转运蛋白基因NrtA的表达较野生型显著下调。在CZA、PDA和1/4 SDAY培养基中,其分生孢子产量分别较野生型降低了21.6%、16.2%和25.6%。逆境胁迫分析发现,在高温（32℃）,高渗（1 mol/L NaCl）和H₂O₂处理后,ΔNirA1菌落生长抑制率较野生型分别降低29.0%、25.2%及49.0%;但在添加SDS和刚果红（CR）的处理中,突变体菌落的生长抑制率分别较野生型升高34.1%和96.2%。因此,缺失NirA后,菌株对SDS和CR更加敏感,但对高温、H₂O₂和NaCl的耐受性提高。以3龄的大蜡螟为试虫的毒力测定表明,敲除NirA1基因导致菌株的毒力提高,半致死时间较野生型提前17.4%。[结论] NirA1在球孢白僵菌生长过程中参与了氮源的利用,并在球孢白僵菌的菌落生长、分生孢子生产、胁迫反应和致病宿主过程中发挥了重要作用。     

金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因MaJEN1及其启动子的克隆与分析

用YADE法扩增了球孢白僵菌T—DNA插入突变体T12中与T—DNA左边界相连的基因组序列。在此基础上得到了金龟子绿僵菌的羧基转运蛋白的全长cDNA,MaJEN1。MaJEN1全长1695bp,其中含有长为1524bp的开放阅读框(0RF),编码508个氨基酸的蛋白。氨基酸序列与粗糙脉孢霉和啤酒酵母菌的羧基转运蛋白JEN1相似性分别为69％和31％。采用PCR扩增得到了MaJEN1的基因组序列GMaJEN1,序列分析发现,GMaJEN1含有两个内含子。Southern杂交发现GMaJEN1在金龟子绿僵菌基因组上为单拷贝。利用RT—PCR法对MaJEN1的表达特性进行了分析,结果表明MaJEN1在蟑螂壳诱导培养基中表达,在该培养基中的表达受葡糖糖抑制。进一步采用YADE法得到了长为1626bp的GMaJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列。     

白僵菌孢子悬乳剂田间控蚜效果与常温货架寿命测定

将高纯度球孢白僵菌分生孢子粉兑入一种含悬浮稳定剂及紫外保护剂的矿物油中,配成含孢量为100亿/ml的孢子悬乳剂(纯菌剂),再添加3%的吡虫啉10%可湿剂而得菌药混配剂,于2003年5月在浙江余姚进行了防治蔬菜蚜虫的田间药效试验和农户示范。在两块夏熟白菜地中,纯菌剂和菌药混配剂均用1000倍稀释液(107个孢子/ml)常规喷雾2次,并设清水对照和低用量吡虫啉对照。结果表明,混配剂在两块菜地的相对防效分别达94.5%和86.2%,纯菌剂分别达86.4%和73.1%,而低用量吡虫啉处理的最高防效仅为50%左右。在入夏豇豆、甘蓝、白菜、萝卜及梨树上用菌药混配剂1000倍稀释液对多种蚜虫进行的农户示范试验中,一次性喷雾后5~10d内对菜蚜防效为48%~68%,尤对梨二叉蚜的防效高达99%。在对含有和不含添加剂的两配方孢子悬乳剂进行的常温避光18个月贮存中,活孢率在头7个月均稳定在95%左右且未受配方影响,第10个月活孢率仍有75%左右。而后,含添加剂配方的活孢率下降加速,至16个月时基本失活;而不含添加剂配方的活孢率在第16、17及18个月时还有57%、51%和42%。     

球孢白僵菌Bb174固态发酵产几丁质酶产酶及酶学特征研究

对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Bb174产几丁质酶进行了固态发酵条件及酶学特征的研究．结果表明,以4：1麸皮：蚕蛹粉、蛋白胨1g·L^-1作为产酶最适培养基,在7．5g培养基中接种3ml液态种子,自然pH下28℃培养2d,酶活可达最高,为126U·g^-1(干培养基)．粗酶液的最适反应温度为40℃,最适反应pH5．0,在30-70℃保温1h,得半失活温度48℃．在30--40℃、pH4～6范围内,酶的性质最稳定．根据Lineweaver-Burk作图法,得到该酶的动力学参数Km为0．52mg·ml^-1,Vm为0．7△E680·h^-1．     

提高布氏白僵菌产孢量的培养基及培养条件研究

采用液固两相培养法,筛选出了适用于培养布氏白僵菌Bbr84菌株的培养基,并测定了培养基、培养时间和光照条件对产孢量的影响.结果表明:用液固双相培养法培养布氏白僵菌获取高孢粉,在液相培养阶段,SDAY+2%麦芽糖是较好的培养基;固相培养阶段,以大米+稻壳+黄粉虫粪组合产孢量较高,且在培养的第五天白僵菌产孢量即达到高峰,这比已报道的其他培养料配方的产孢高峰时间缩短2-3天.培养前期,应以黑暗环境为主,以增强菌丝生长,但后期应适当供给光照,以促进菌丝大量产孢.     

马尾松纯林虫生真菌群落组成及优势种生态位研究

对麻姑山马尾松纯林的虫生真菌群落进行了调查研究,共发现了3科6属14种。该林区虫生真菌群落的主要成分是环链棒束孢、球孢白僵菌和粉棒束孢,虫生菌种类较少,较为单一。对3种优势虫生真菌环链棒束孢、球孢白僵菌和粉棒束孢的营养、时间及营养-时间二维生态位进行了分析。结果表明,环链棒束孢与粉棒束孢的营养生态位重叠度最大,与球孢白僵菌时间生态重叠度最大。而球孢白僵菌的营养生态位宽度、时间生态位宽度和营养-时间二维生态位宽度都为最大。球孢白僵菌在自然界中发生时间长,分布范围广,寄主昆虫丰富,生存能力强的实际情况也支持这一分析结果。     

本期重点推介

正蜜蜂Apis spp.是具有级型分化的社会性昆虫。揭示其级型分化及调控机理,对认识社会性昆虫的演化形成机制、不同级型的发育和维持机理以及对其更好地加以应用均有重要的参考价值。已有研究表明,蜂王浆的主要蛋白成分———王浆主蛋白(major royal jelly proteins,MRJPs)在蜜蜂的级型分化中具有重要的功能。mrjp8是mrjps家族中较晚发现的一个成员。为了进一步明确mrjp8基因表达与蜜蜂级型分化的关系,福建农林大学蜂学学院李江红等对西方蜜蜂Apis mellifera不同发育龄期工蜂体内,以及成年工蜂、新出房蜂王和雄蜂不同组织中的mrjp8表达水平进行了检测,发现