癌基因Src在骨肉瘤细胞侵袭伪足形成中的作用

目的:探讨癌基因Src在体外培养骨肉瘤细胞侵袭伪足形成中的作用。方法:构建Src sh RNA慢病毒表达载体,在HEK293T细胞中包装慢病毒,感染HT-1080骨肉瘤细胞,经嘌呤霉素加压筛选,获得稳定沉默Src基因的骨肉瘤细胞系HT-1080-sh Src;实时定量PCR和Western Blot法检测基因沉默效率;采用原位明胶酶谱法检测侵袭伪足形成;采用侵袭小室实验检测下调Src基因表达对HT-1080细胞侵袭力的影响。结果:成功构建稳定沉默Src基因的骨肉瘤细胞系HT-1080-sh Src及对照细胞系HT-1080-shluc,经实时定量PCR和Western Blot检测,与对照细胞系相比,HT-1080-sh Src细胞中Src基因表达下调3倍以上;下调HT-1080细胞中Src基因表达能显著抑制HT-1080细胞侵袭伪足形成及其对细胞外基质的降解能力;下调Src基因表达能显著抑制骨肉瘤细胞侵袭力。结论:癌基因Src参与调节骨肉瘤细胞HT-1080侵袭伪足形成,促进肿瘤侵袭、转移。     

PD-L1基因敲除小鼠构建及初步表型验证

目的 程序性死亡配体-1(PD-L1)是免疫调节途径的重要因子,是抗肿瘤免疫疗法中重要的靶标之一。利用CRISPR/Cas9技术成功构建PD-L1基因敲除小鼠模型,并初步分析其表型。方法 构建Cas9和sgRNA载体,并转录获得RNA,通过显微注射方式将RNA注射到C57BL/6小鼠受精卵中,经过鉴定获得F₀代阳性小鼠。F₀代小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配获得F₁代杂合子小鼠,再通过F₁代小鼠自交获得F₂代纯合子小鼠品系。随后通过Real-Time PCR和流式实验分别检测PD-L1基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果 Real-Time PCR和流式实验检测结果显示与野生型C57小鼠相比,PD-L1纯合子小鼠的PD-L1 mRNA相对表达水平和细胞上的蛋白质表达均有显著性下降,仅测定到本底的信号,证实已成功构建PD-L1基因敲除小鼠品系,为PD-L1体内基因功能研究提供了新的小鼠模型。     

利用CRISPR/Cas9技术建立敲除JAK2基因K562细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9技术对K562细胞系JAK2基因进行编辑,构建JAK2基因敲除的K562细胞系。方法:使用CRISPR在线设计工具,针对JAK2基因设计sgRNA,构建Cas9-sgRNA共表达质粒。使用第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染K562细胞,提取细胞基因组DNA,Sanger测序和TA克隆检测基因编辑活性。无限稀释法将编辑阳性的细胞接种于96孔板并扩培得到单克隆细胞株,提取基因组DNA,Sanger测序和TA克隆分析敲除JAK2单克隆细胞的基因型。结果:成功构建靶向敲除JAK2基因的lentiCRISPRv2-sgRNA3-1质粒。优化方案得到低细胞毒性高转染效率的感染K562细胞慢病毒量。CRISPR/Cas9系统成功在JAK2基因sgRNA3-1识别位点发挥基因组编辑活性,获得纯合敲除JAK2基因细胞株K562-JAK2~(-/-)(两个等位分别发生移码突变,预期编码没有功能的JAK2蛋白)。结论:CRIAPR/Cas9系统通过慢病毒感染方式获得JAK2基因纯合敲除的K562细胞株,该细胞模型可用于研究在慢性髓系白血病中JAK2基因的作用,为构建K562敲除其他基因细胞系提供实验依据,为探究造血分化机制的研究奠定实验基础。     

马尔尼菲篮状菌基因研究进展

温度依赖性双相真菌马尔尼菲篮状菌可致局限性或全身播散性感染,在东南亚以及我国南方,尤其是广西、广东有区域性流行。该菌主要感染免疫力低下的人群,是流行区艾滋病患者特征性的机会性感染。文中主要介绍马尔尼菲篮状菌的相关基础知识、基因研究历史进程以及综述马尔尼菲篮状菌在生长发育、双相转换、信号通路、细胞壁合成、细胞代谢、应激反应、热休克、色素、毒力及耐药方面的基因研究进展。     

紫花苜蓿F-box蛋白基因MsFTL的克隆及功能分析

FTL(F-box Triple LRR protein)是F-box蛋白家族的成员,具有F-box保守结构域,在植物抵御逆境胁迫过程中起重要作用。本研究参考低温胁迫下紫花苜蓿转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsFTL基因,该基因的全长1422 bp,编码473个氨基酸。该蛋白含有1个F-box结构域及3个LRR重复。系统进化分析表明,MsFTL与蒺藜苜蓿XP_003626345.1 F-box/FBD/LRR-repeat protein亲缘关系最近。两者蛋白序列比对发现共有11个差异位点。在低温、盐、干旱以及外源ABA处理下,MsFTL基因受到诱导,表达量上调。构建植物过表达载体pCBM-MsFTL,通过农杆菌介导法转化烟草。对经过抗性筛选、PCR和Real-time PCR验证的转基因植株进行低温抗性鉴定。在-4℃低温胁迫下,野生型烟草叶片出现了明显的萎蔫失水现象,而转基因烟草萎蔫程度相对较轻。生理检测结果表明,4℃处理24 h之后,转基因烟草的可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、SOD活性,CAT活性高于野生型,MDA含量低于野生型。本研究表明,MsFTL基因在提高植物对低温胁迫的抗性方面具有重要的作用。     

核、质基因对肺形侧耳菌丝生长、营养成分及基因表达的影响

本研究通过杂交构建肺形侧耳同核异质菌株N1M1、N1M2和同质异核菌株N1M1、N2M1,比较菌丝形态与生长速度、营养成分以及常见的细胞核基因与线粒体基因的表达量,分析线粒体基因对肺形侧耳菌丝的影响,探讨线粒体基因与核基因的相互作用。由菌丝生长情况可知N1M1和N1M2菌丝形态相似,生长速度差异不显著,N1M1和N2M1菌丝形态差异大,生长速度差异极显著,在菌丝形态与生长速度上细胞核基因作用大于线粒体基因。进一步检测菌株中的主要营养成分发现必需氨基酸与总水解氨基酸含量差异显著,菌株N1M2蛋白含量显著高于N1M1,N1M1维生素C含量是N1M2的1.67倍,菌株N2M1多糖和蛋白含量显著高于N1M1,铁和维生素C含量显著低于N1M1。所以细胞核基因、线粒体基因都能影响肺形侧耳营养成分含量。检测同核异质菌株N1M1、N1M2的7个细胞核常见基因的表达情况发现,N1M2菌丝中6个细胞核基因的表达量都显著高于N1M1,这表明肺形侧耳线粒体基因的不同会影响核基因的表达;同质异核菌株N1M1、N2M1的14个线粒体普通编码蛋白基因表达差异显著,这说明线粒体基因的表达量会因核基因的不同有所差异。综上,肺形侧耳线粒体基因和细胞核基因能够相互影响,共同作用于生命活动。