枸杞Lb_SPL12基因的克隆及表达分析

SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)是植物发育过程中特有的转录因子,SPL基因家族由多个成员组成.本研究通过RACE方法克隆到枸杞Lb SPL12转录因子的全长cPNA.研究结果表明,该cDNA基因的开放阅读框包含1 353 bp个碱基,编码450个氨基酸.Lb_SPL12蛋白的二级结构中含有无规则卷曲、α螺旋、延长链和β转角.氨基酸序列分析发现,不同物种的SPL12蛋白在氨基酸序列以及基序种类上具有较高的相似性.实时荧光定量PCR分析显示,Lb_SPL12基因在枸杞的花器官中表达,且在花药发育的小孢子发育时期表达量最高.亚细胞定位结果进一步证实了Lb_SPL12蛋白定位在细胞核中.初步推测,枸杞Lb SPL12转录因子可能在枸杞花器官发育过程中发挥了重要作用.本研究为进一步揭示枸杞Lb_SPL12的作用机制提供了分子基础.     

胶质射脉革菌(Phlebia tremellosa)单核菌株的制备与单核体筛选

为获得胶质射脉革菌(Phlebia tremellosa)BBEL0901的单核体,本研究首先考察了溶壁酶的浓度、菌龄、酶解时间、稳渗剂浓度等因素对原生质体产量的影响,进而采用正交试验优化影响原生质体制备的关键条件,最后基于细胞核染色的方法鉴定单核菌株,基于ITS序列对单核体进行分子鉴定后采用二代测序技术对单核体的全基因组DNA进行检测.结果表明:采用马铃薯葡萄糖(PDB)加富培养基中静置培养4.5 d的菌丝,以0.65 mol/L氯化钠为稳渗剂,用5％的溶壁酶酶解3 h的原生质体产量最大;通过荧光染色和显微镜观察获得了三株单核菌株,对单核菌株M73的全基因组测序显示胶质射脉革菌的基因组为36.1 Mb,杂合度较低.本研究为胶质射脉革菌全基因组测序及基因功能的验证提供了可靠的实验材料.     

表达结核分枝杆菌CFP10基因的重组腺病毒对A549细胞炎性因子的影响

通过构建表达结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）CFP10基因的重组腺病毒,探讨CFP10蛋白对A549细胞炎性因子表达的影响。采用酶切、连接的方法将CFP10编码基因插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-AdV4中,构建重组穿梭质粒pShuttle-AdV4-CFP10,重组穿梭质粒经测序验证后和骨架质粒pGP-Ad-Pac Vector经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后共转染至HEK 293A细胞中进行病毒包装,获得重组腺病毒AdV4-CFP10,经定量PCR和Western blot验证后进行病毒扩增,CsCl密度梯度离心纯化获得高纯度的重组腺病毒。AdV4-CFP10感染Ⅱ型肺泡上皮细胞A549,利用荧光定量PCR和ELISA技术检测A549细胞中细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α等的表达水平,初步探究CFP10对A549细胞炎性因子分泌的影响。成功构建了表达结核分枝杆菌CFP10基因的重组腺病毒AdV4-CFP10,AdV4-CFP10转染至A549细胞后,与空病毒相比,过表达CFP10显著上调A549细胞炎性因子的分泌水平。为进一步深入研究结核分枝杆菌CFP10蛋白对A549细胞炎性反应的调控机制提供参考。     

结核分枝杆菌CFP10和ESAT6对巨噬细胞RAW264.7凋亡及AIM2/ASC/Caspase-8通路的影响

【背景】10 kD培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10,CFP10)和6 kD早期分泌性抗原靶蛋白(early secretary antigenic target-6 kD,ESAT6)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)重要的毒力因子,能引起巨噬细胞的凋亡。【目的】探讨CFP10和ESAT6对巨噬细胞RAW264.7凋亡及AIM2/ASC/Caspase-8信号通路的影响。【方法】利用大肠杆菌表达并纯化获得了CFP10和ESAT6蛋白,重组蛋白处理巨噬细胞RAW264.7后,利用CCK8试剂盒检测细胞存活率,确定重组蛋白处理细胞浓度,利用Western blotting技术检测细胞凋亡相关蛋白及AIM2和ASC炎性小体的变化,利用流式细胞术检测细胞凋亡率。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果表明重组蛋白CFP10和ESAT6表达正确,不同浓度的CFP10和ESAT6处理RAW264.7后,对细胞的增殖能力具有明显的抑制作用,当CFP10和ESAT6单独处理且浓度为5 μg/mL时,细胞存活率较对照组有显著下降(P<0.001),且随着蛋白浓度的增加细胞存活率显著下降(P<0.001)。Western blotting结果表明,CFP10和ESAT6蛋白单独处理巨噬细胞24 h后均能引起巨噬细胞发生凋亡。当终浓度为5 μg/mL的CFP10和ESAT6共处理巨噬细胞时,共处理组凋亡相关蛋白BAD、CHOP、Caspase-8和Caspase-3较ESAT6单独处理组有极显著差异(P<0.001),说明CFP10和ESAT6共处理显著降低了ESAT6单独处理引起的巨噬细胞的凋亡,进一步研究发现ESAT6能激活AIM2、ASC炎性小体。【结论】结核分枝杆菌CFP10和ESAT6处理RAW264.7后均能引起巨噬细胞发生凋亡,当二者共处理时,CFP10会显著降低ESAT6单独处理引起的细胞的凋亡,进一步的研究表明,ESAT6可能通过激活AIM2/ASC/Caspase-8信号通路从而引起巨噬细胞发生凋亡。研究结果为进一步探究Mtb感染过程中CFP10和ESAT6蛋白对巨噬细胞凋亡的调控作用及其分子机制奠定了基础。     

贺兰山榆跳象幼虫空间分布特征及影响因子分析

【目的】明确贺兰山榆跳象Orchestesalni幼虫空间分布型及其形成机制,分析影响榆跳象幼虫空间分布的因子,以期为榆跳象的预测预报及防控措施提供参考。【方法】对贺兰山灰榆林榆跳象幼虫平均密度进行调查,应用6种聚集度指标法和2种回归模型法分析榆跳象幼虫的空间分布型。【结果】贺兰山中部沟道灰榆榆跳象幼虫密度明显高于南北沟道。半阴坡和阴坡榆跳象幼虫平均密度显著高于阳坡和沟道。灰榆树冠不同方向的幼虫平均密度差异不显著,以树冠中下层最大。榆跳象幼虫密度与树干高呈显著正相关。榆跳象幼虫在贺兰山灰榆林中呈聚集分布,基本成分是个体群,个体间相互吸引,并随种群密度升高,聚集程度增大。聚集分布是由昆虫行为或环境条件引起。灰榆林海拔和坡度显著影响榆跳象幼虫密度,榆跳象幼虫主要聚集在海拔1 800 m以上(29.00%)和急坡(24.08%)的灰榆林。【结论】贺兰山中部沟道的中海拔区域是榆跳象发生的重点监测区域,背风且水分条件好的坡向密度大,榆跳象幼虫聚集分布容易造成局部区域密度较高。     

载产肠毒素性大肠杆菌ST-LTB融合蛋白纳米疫苗的制备及特性鉴定

利用IPTG诱导大肠杆菌ST-LTB融合基因表达,获取了大量包涵体蛋白并进行纯化。用PEG-400作为载体材料,辅以蜂胶和span-60等佐剂包裹ST-LTB融合蛋白,制备成PEG-400复合佐剂纳米疫苗,并使用透射电镜观察所制得纳米粒的形态,用考马斯亮蓝G-250法检测其载药率。结果表明:电镜观察所制得的纳米粒为球形,粒径在55-75nm之间分布。PEG-400复合佐剂纳米疫苗抗原载药率为73.22±0.21%,符合纳米疫苗的工艺要求。     

宁夏枸杞叶总黄酮提取和纯化方法的优化

采用L9(3⁴)正交设计,以黄酮含量为指标,确定的宁夏枸杞叶总黄酮的最佳超声提取方法为: 30倍70%乙醇超声提取50 min,超声功率为250 W;纯化方法条件为: 5倍柱体积70%乙醇洗脱,浓度为4 mg/mL、pH值5.0的上样液,上样速度和洗脱流速均为1 mL/min。并以吸附率、解吸率、回收率等作为考察参数,对提取和纯化方法进行了验证。实验结果表明,该方法简便节时、易操作且毒害小,各项变异系数低。     

宁夏荒漠草原小叶锦鸡儿可培养内生细菌多样性及其分布特征

对宁夏荒漠草原小叶锦鸡儿各部分组织中可培养内生细菌的遗传多样性和分布特征进行了分析,并对菌株的耐盐性、耐酸碱性和生长温度范围进行了测定。结果表明:各部分组织中内生细菌的数量和群落组成存在明显差异,根部细菌种群密度最大,分离数量最多,叶部次之,茎部和种子数量最少。78株分离菌株经16S rDNA-RFLP分析共产生9种遗传图谱类型,16SrDNA序列分析表明供试菌株分别归属于芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属、假单胞菌属、贪铜菌属、罗尔斯顿菌属和中华根瘤菌属,与其它植物相比多样性较为单一;芽孢杆菌属是小叶锦鸡儿的优势内生菌群(占87.2%),分布于所有组织中。菌株的抗逆能力较强,多数菌株可耐受6%的NaCl,能在pH值5.0—10.0及45℃的条件下生长,3株芽孢杆菌属细菌具有较强的耐盐、耐酸碱、耐高温性能。     

荒漠景观下柠条豆象的空间分布及其对景观斑块格局的反应

柠条豆象Kytorhinus immixtus Motschulsky是危害柠条种子的主要种实害虫之一。本文应用了多个聚集度指标和回归分析方法,研究探讨了柠条豆象卵、幼虫在宁夏盐池、灵武、银川等荒漠景观中11个生境斑块中的空间分布型及种群对景观斑块格局的反应情况。结果表明:在11个景观样地中,柠条豆象卵和幼虫在各种生境斑块中均呈聚集型的负二项分布;卵和幼虫空间分布的Iwao回归方程分别为m*=2.23695+1.64742m(r=0.8273)和m*=2.24418+1.42084m(r=0.8889)、Taylor幂模型分别为logS2=0.51292+1.41118logm(r=0.9344)和logS2=0.59645+1.14736logm(r=0.9786),种群分布的基本成分为个体群,个体间相互吸引,有密度依赖性,聚集主要由环境因素和种间竞争引起的,聚集强度随种群密度的升高而增加。在荒漠景观下,柠条豆象的种群发生与寄主植物的种类、在斑块内的分布格局有着密切的关系,与斑块面积相关性较低(R2=0.1995)。主成分分析显示柠条林生长的土壤类型、生长方式是影响柠条豆象寄生的主要因素。