微生物1,3-1,4-β-葡聚糖酶蛋白质改造及工业应用研究进展

1,3-1,4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)是一种重要的工业用酶,其可以通过特异性切割毗邻β-1,3-糖苷键的β-1,4-糖苷键将β-葡聚糖或地衣多糖降解为纤维三糖和纤维四糖。微生物β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族16,其三维结构为卷心蛋糕状的逆向β-片层结构。文中综述了近些年来β-葡聚糖酶在工业上的应用情况及酶蛋白质工程改造的研究进展,并对其研究前景进行了展望。     

枯草芽孢杆菌中一种新型双向启动子的功能鉴定

本研究旨在通过转录组分析预测的方法,由地衣芽孢杆菌中筛选获得一种新型双向启动子,鉴定其启动强度。以已知强组成型启动子pShuttle-09为对照,检测其对克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达活性。成功构建了3种重组碱性蛋白酶表达载体及对应的工程菌株。在新型启动子pLA和其反向启动子pLB调控转录下,克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶表达活性达到164 U/mL和111 U/mL。结果表明,pLA的启动强度明显高于pShuttle-09和pLB,pLA启动子与pLB启动子均可表达碱性蛋白酶。从而为枯草芽孢杆菌表达系统中异源基因的表达提供一个新的方向,也为原核生物中共同表达两种基因提供了新的思路。     

紫色马铃薯花青素StAN1基因的克隆及功能分析

MYB是植物花青素合成代谢途径中最主要的转录因子。该研究以紫色马铃薯B-5为试验材料,通过同源克隆技术,克隆了马铃薯花青素StAN1基因,并对StAN1基因的表达、遗传转化及其转基因烟草的花青素含量进行分析。结果表明:(1)StAN1基因全长774bp,编码了258个氨基酸;系统进化树分析发现,StAN1与辣椒、茄子、芦竹的亲缘关系最近,与矮牵牛、苹果等的亲缘关系最远。(2)荧光定量PCR分析显示,StAN1基因在马铃薯不同组织均有表达,其表达量从小到大依次为:根叶茎匍匐茎薯皮薯肉。(3)成功构建了表达载体pJAM1502-AN1,并经农杆菌(Gv3101)转化获得根、茎、叶片及叶脉均为紫红色的转StAN1基因烟草,PCR鉴定表明目的基因StAN1已成功转入烟草中。(4)花青素含量分析表明,野生型烟草叶片中花青素含量为2mg/g,叶片颜色为绿色,而转StAN1基因烟草叶片花青素含量达20mg/g,叶片颜色变成了紫红色。     

癫痫模型大鼠海马CA1网络theta节律断裂的观察*

目的:探究尖波间期和无尖波恢复期颞叶癫痫大鼠模型的海马CA1网络theta节律随癫痫发展进程的变化规律。方法:14只成年雄性Wistar大鼠(200～250 g)麻醉后开颅,在海马的背侧埋入一个双极性钢电极(直径小于1 mm),在颅骨上埋入三个不锈钢皮质电极,在左和右额皮质内分别植入两个电极,在小脑埋入参考电极,粘合颅骨,检测、记录大鼠脑电图;之后腹腔注射癫痫诱发药物,匹罗卡品氢氯化物(pilocarpine hydrochloride,310 mg/kg),30 min后给予大鼠莨菪碱 (scopolamine, 1 mg/kg);借助14只大鼠在嗅行(exploration)时脑深部记录(SEEG),应用Gabor小波时频能量分析估算断裂段数(以350 ms为1段),与总段数的比值定义为断裂比,用来衡量theta节律断裂程度,分别计算了癫痫发展进程的早期(D7)和晚期(D25)中两个邻近尖波之间时间段(定义为尖波间期)和随后无尖波恢复期theta节律断裂比,与注射前脑电图比较。结果:① 与对照脑电图比较,癫痫诱发大鼠的D7和D25的theta节律断裂比显著升高(P＜0.05),并且D7远高于晚期D25;② 在无尖波恢复期,theta节律断裂比与尖波间期相当 (P＜0.05)。结论:癫痫尖波直接导致了theta节律断裂,断裂程度将随癫痫发展进程而动态变化,早期伤害尤其严重。     

杨芽黄素对前列腺癌细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨杨芽黄素对前列腺癌细胞22Rv.1的作用及机制。方法:将0~20μg/ml杨芽黄素作用于22Rv.1细胞和正常前列腺细胞RWPE-1,适时采用MTS法检测细胞的增殖活性,采用流式细胞仪、hoechst染色、LDH释放实验分别检测22Rv.1细胞凋亡、死亡、周期、核型变化和药物的细胞毒作用,利用qPCR和Westernblot分析22Rv.1细胞内基因转录和蛋白表达的改变,并通过抑瘤实验证实该药的抑癌作用。结果:杨芽黄素可显著抑制22Rv.1细胞增殖、诱导其凋亡,促进22Rv.1细胞凋亡相关基因dr4、dr5、trail、p53、caspase-3、caspase-8、caspase-9、bid、bax、foxo3的表达,并抑制抗凋亡基因akt、pi3k和bcl-2的表达。结论:杨芽黄素可通过影响TRAIL和PI3K/AKT信号通路诱导前列腺癌细胞凋亡,具有抗前列腺癌的作用。     

高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤对程序性坏死的影响及其机制*

目的: 探讨程序性坏死在高糖诱导的大鼠原代心肌细胞损伤中的变化及可能机制。方法: 原代大鼠心肌细胞随机分为4组(n=9):正常对照组(Control,5.5 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、高糖组(HG,30 mmol/L葡萄糖培养心肌细胞48 h)、HG+Nec-1(30 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L程序性坏死关键蛋白RIP1抑制剂Nec-1共同培养心肌细胞48 h)组、高渗组(HPG,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇共同培养心肌细胞48 h)。MTT法检测各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测细胞氧化应激水平,ELISA法检测心肌细胞TNF-α、IL-6及IL-1β水平,Real-time PCR和Western blot分别检测各组程序性坏死关键蛋白RIP1、RIP3、MLKL mRNA和蛋白水平的表达情况。结果: 与Control组相比,HG组心肌细胞活力明显降低(P＜0.01),氧化应激水平明显增高(P＜0.01),TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高明显(P＜0.01),RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均明显升高(P＜0.05);与HG组相比,HG+Nec-1组心肌细胞活力明显升高(P＜0.01),氧化应激水平明显下降(P＜0.01),TNF-α、IL-6及 IL-1β水平明显降低(P＜0.01), RIP1、RIP3、MLKL mRNA及蛋白水平表达均下降(P＜0.05)。结论: 高糖诱导的原代大鼠心肌细胞损伤可引起程序性坏死的发生;抑制程序性坏死可减轻细胞损伤的机制,可能与抑制氧化应激、减轻炎症反应有关。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重叠存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。     

铜绿假单胞菌一氧化氮还原酶编码基因norD的生物学功能研究

一氧化氮还原酶(Nitric oxide reductase,NOR)是反硝化过程中一个非常重要的催化酶,本文通过同源重组的方法敲除铜绿假单胞菌中norD基因,并研究该基因敲除后菌株ΔnorD在好氧条件下的表型变化。研究结果表明,与野生菌株和回补菌株相比,ΔnorD对BIT的抗性增强。同时在BIT作用下,ΔnorD泳动能力减弱、绿脓菌素的合成能力降低,但norD基因不是BIT唯一的作用位点。上述结果明确了好氧条件下norD基因的部分功能,为更好的利用反硝化过程奠定基础。     

利用小鼠骨骼肌细胞持续表达单链胰岛素类似物进行1型糖尿病模型鼠的长效基因治疗

目的探讨Pluronic L64-电脉冲(L/E)体系介导的单链胰岛素类似物基因在骨骼肌组织的传递表达对1型糖尿病小鼠的治疗效果和影响。方法将胰岛素基因中的C肽区域换成(GGGGS)_3,克隆到pcDNA3.1(+)质粒中,构建载体pcDNA-INS。使用链脲佐菌素腹腔注射雄性BALB/c小鼠建立1型糖尿病小鼠模型,并分为L/E联合pcDNA3.1(+)空质粒治疗的L/E-pcDNA3.1(+)组、仅使用pcDNA-INS裸质粒治疗的pcDNA-INS组和L/E联合pcDNA-INS裸质粒治疗的L/E-pcDNA-INS组。模型小鼠在胫骨前肌注射相关质粒进行治疗,且根据治疗方案在注射1 h后进行Pluronic L64-电脉冲处理,并以生理盐水处理的正常小鼠(NC)组作为对照。记录各组小鼠的血糖、体质量、血清胰岛素含量、生存率、免疫组化、外形特征及组织病理等指标。结果 (1)pcDNA-INS质粒通过酶切和测序鉴定无误;(2)与NC组相比,模型小鼠血糖显著上升,体质量显著下降(P0.05),且胰岛遭到严重破坏;(3)L/E-pcDNA-INS组的血糖水平和血清胰岛素含量显著缓解,与NC组较为接近,pcDNA-INS组的血糖缓解和胰岛素补偿远不及L/E-pcDNA-INS组(P0.05),且与NC组之间的差异一直有统计学意义(P0.05)。第4周免疫组化结果显示,L/E-pcDNA-INS组的胰腺胰岛素表达较少,但肌肉胰岛素表达量较高,且该组生存率较高,与NC组均为100%(12/12),L/E-pcDNA-INS组的病理结果和外形特征与NC组小鼠最为接近,L/E-pcDNA3.1(+)组与pcDNA-INS组在不同部位均有不同程度的病变发生,且鼠毛疏少粗糙,体形较小。结论 Pluronic L64-电脉冲体系与单链胰岛素类似物基因联合治疗1型糖尿病的效果较好,且无明显不良影响,可为相关研究提供实验依据。