海参资源及其生物活性物质的研究

海参属棘皮动物门海参纲,是海洋中重要的食物和药物资源。全世界海参资源比较丰富,目前已知约有1000种,我国约有140多种。海参含有多种生物活性物质,如多糖、甾醇、皂苷、脂肪酸和毒素等,具有增加免疫力、抗肿瘤、抗凝血、保护神经组织、镇痛、抗真菌、降低血黏度等作用。本综述了国内外海参资源分布、海参生物活性物质组成及其药理作用。     

一种真菌对人参皂苷Rg3的转化

[目的]筛选长白山人参土壤中的活性微生物,转化人参总皂苷及单体人参皂苷产生稀有抗肿瘤成份.[方法]从长白山人参根际土壤中分离各类菌株,对人参总皂苷及单体人参皂苷进行微生物转化,并通过硅胶柱层析等方法对转化产物进行分离纯化,采用波谱解析及理化常数对其进行结构鉴定;结合菌落形态、产孢结构、孢子形态特征以及菌株ITS rDNA核酸序列分析,对活性菌株进行鉴定.[结果]从长白山人参根际土壤中分离各类真菌菌株68株,有12株菌株对人参总皂苷有转化活性,其中菌株SYP2353对二醇组人参皂苷Rg3具有较强的转化活性.[结论]阳性菌株SYP2353被鉴定为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria),能将人参皂苷Rg3转化为稀有人参皂苷Rh2及二醇组人参皂苷苷元PPD,为稀有人参皂苷Rh2的制备提供了新的方法.     

仙茅中两个新的环阿尔廷醇型三萜皂苷

从仙茅(Curculigo orchioides）中分离得到2个新的环阿尔廷醉型三萜皂苷,通过波诺分析鉴定了它们的化学结构,即3β,11α,16β—三羟基环阿尔廷烷-24-酮-3-O-[β-D-吡喃葡糖(1→3)-β-D-吡喃葡糖(1→2)-β-吡喃葡糖]-16-O-α-L-阿拉伯糖苷(1)和(24S)-3β,11α,16β,24-四经基环阿尔廷烷-3-O-[β-D-吡喃葡糖(1→3)-β-D-吡喃葡糖(1→2)-β-D-吡喃葡糖]-24-O-β-D-吡喃葡糖苷(2)。     

脱乙酰壳多糖处理增加人参细胞皂苷的累积和皂苷合成关键酶基因的转录

脱乙酰壳多糖处理可以诱导人参细胞产生H2 O2 ,增加人参皂苷的累积 ,提高鲨烯合酶 (squalenesynthase,GSS)与鲨烯环氧酶 (squaleneepoxidase,GSE)基因的转录水平。质膜NADPH氧化酶的抑制剂DPI,H2 O2 的淬灭剂DMTU与DHC可以抑制脱乙酰壳多糖的这些效应 ,暗示脱乙酰壳多糖可以活化质膜NADPH氧化酶而产生H2 O2 ,H2 O2 进而作为第二信使诱导gss与gse基因转录以及皂苷的合成。质膜钙通道抑制剂LaCl3与内质网钙通道抑制剂RR ,以及蛋白激酶抑制剂K2 5 2a都能削弱脱乙酰壳多糖促进皂苷积累和gss、gse转录的效应 ,说明胞内Ca2 浓度的升高与蛋白质磷酸化都参与了脱乙酰壳多糖诱导的gss、gse的转录以及皂苷的合成     

用单性结实基因2A11-iaaM转化罗汉果的研究

为了实现罗汉果生产中免除人工授粉和果实无籽化,该研究利用pBI121-Gus构建果实特异启动子2A11与生长素合成相关基因iaaM的嵌合基因(2A11-iaaM)过量表达载体,以罗汉果雌株叶盘为材料,采用农杆菌介导法建立罗汉果高效遗传转化体系,转化和创制单性结实罗汉果种质,通过基因特异引物对的PCR扩增,初步检测出转基因阳性植株,将之移栽大田,观察转基因植株的单性结实性的表现。结果表明:构建罗汉果单性结实性相关的pBAI-Gus植物双元表达载体获得成功;建立了农杆菌介导的罗汉果叶盘遗传转化优化体系,即农杆菌菌液OD_(600)值为0.3～0.5,侵染10 min,最优选择培养基为MS+TDZ 0.7 mg·L~(-1)+IBA 0.5 mg·L~(-1)+Kan 5 mg·L~(-1)+Cef 300 mg·L~(-1);经PCR鉴定共获得4株转基因阳性雌株;将阳性植株扩繁后移栽田间,经田间调查发现,24株阳性扩繁植株中有5株正常开花,占总植株数的20.8%,且其子房未经人工授粉发育成幼果,表现单性结实性。在载体构建和农杆菌介导的罗汉果遗传转化体系优化的基础上,将外源单性结实相关嵌合基因整合进罗汉果基因组并得到表达,为后续研究单性结实罗汉果的遗传生理,创制转基因罗汉果单性结实新种质,以及克服其产业化中需要人工授粉和无籽化提供了理论和应用基础。     

美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素

为了探讨利用美洲商陆毛状根生产其药用成分的可能性,研究了美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的影响因素。结果表明,美洲商陆叶片外植体被发根农杆菌ATCC 15834感染约18 d后,从其叶片外植体形态学下端叶脉切口处产生毛状根,其中以预培养1 d,农杆菌感染20 min,共培养4 d时的毛状根诱导率最高,达到70%。PCR扩增和硅胶薄层层析结果显示,发根农杆菌Ri质粒的rol C基因以及冠瘿碱合成酶基因已在美洲商陆毛状根基因组中整合和表达。所获得的美洲商陆毛状根系都能在无外源激素的MS固体培养基上快速自主生长;其中以毛状根根系2的生长速度最快、分生侧根能力最强和根表面的根毛密度最高;毛状根根表面呈紫红色或呈白色。在供试的MS、1/2MS、B5和6,7-V液体培养基中,以无外源激素的MS培养基最适合美洲商陆毛状根根系生长。与无外源激素的MS培养基相比,6,7-V培养基更有利于毛状根中商陆皂苷甲的合成与积累。本文所建立的美洲商陆毛状根诱导及其离体培养的适宜条件为今后利用其毛状根株系的规模培养来生产其药用有效成分商陆皂苷甲奠定了实验和技术基础。     

培养条件对三七愈伤组织生长和皂苷积累的影响

以MS为基础培养基,改变激素配比、氮源和光照等因素,以分光光度法和HPLC法分析三七愈伤组织培养过程中皂苷含量的变化。结果表明:培养条件对三七愈伤组织中皂苷积累有一定影响,激素配比对愈伤组织中皂苷含量的影响最大,在0.5 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA组合下,培养物中总皂苷含量最多,达到4.72%±0.29%;在总氮量为60 mmol·L-1条件下,45 mmol·L-1KNO3+7.5 mmol·L-1NH4NO3(NO3-/NH4+=7∶1)时,愈伤组织皂苷含量最多,达到4.71%±0.17%;分别在1 000 lx和500 lx光强下每天光照12 h的愈伤组织,皂苷含量均低于黑暗培养的愈伤组织,三者皂苷含量分别为1.94%±0.31%、2.38%±0.12%和3.57%±0.27%,光照引起愈伤组织表面变绿及细胞分化,可能是抑制愈伤组织中皂苷合成与积累的主要原因;HPLC检测发现,三七愈伤组织和根中均含有Rg1、Re、Rb1及Rd四种皂苷,但栽培三七根含有R1皂苷,而三七愈伤组织中未检测到R1,其原因需要进一步研究。该研究结果为未来愈伤组织培养成为部分代替人工栽培生产三七天然产物的潜在途径提供了研究基础。     

人参皂苷单体Rh2对人鼻咽癌CNE-2S细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨人参皂苷单体Rh2对人鼻咽癌CNE-2S细胞增殖及凋亡的影响。方法:将生长在对数期的人鼻咽癌CNE-2S细胞分为空白对照组、阴性对照组和实验组。对照组常规培养,阴性对照组采用含有DMSO的培养液培养,实验组在对照组细胞的基础上加入不同浓度人参皂苷单体Rh2处理。采用MTT法测定细胞增殖,PI单染流式细胞术分析各时期细胞所占百分比,Annexin V-PI双染流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果:与阴性对照组相比,实验组各浓度下的Rh2对CNE-2S细胞均具有显著的增殖抑制作用(P0.05),且随着Rh2浓度的增加而呈现增强的趋势,其中浓度为12.5 mg·L-1 Rh2增值抑制率最低,浓度为100 mg·L-1Rh2增值抑制率最高。不同浓度人参皂苷单体Rh2 G0/G1期细胞分布显著高于阴性对照组(P0.001),且G2/M、S期细胞比例显著低于阴性对照组(P0.01),且随着人参皂苷单体Rh2浓度的增加作用呈现增强的趋势(P0.05);不同浓度的Rh2单体作用24h,CNE-2S细胞早期、晚期凋亡率及总凋亡率均较阴性对照组明显增高(P0.001),并且在Rh2单体浓度为100 mg·L-1时,凋亡率最高。结论:人参皂苷单体Rh2对人鼻咽癌CNE-2S细胞增殖及凋亡具有显著的影响,并且可能对单体Rh2的浓度存在依懒性。     

三七、栀子有效组分给药的APP/PS1小鼠血清神经递质与行为学的相关性

目的:探讨三七、栀子有效组分及配伍给药对APP/PS1小鼠血清中乙酰胆碱和五羟色胺含量的影响及其与行为学的相关性分析。方法:APP/PS1小鼠随机分成转基因模型组(Tg)、三七总皂苷组(PNS)、栀子苷组(GP)、配伍组(PNS+GP),同窝非转基因小鼠为野生型组(WT),从4月龄开始,以自主进食的方式,分组给药3个月,7月龄时,进行八臂迷宫测试和血清中乙酰胆碱及五羟色胺含量的检测。结果:(1)乙酰胆碱含量测定结果,与野生型组相比,转基因模型组有显著性降低(P0.05);三七总皂苷组、栀子苷组可以显著升高转基因模型组的乙酰胆碱含量(P0.05)。(2)五羟色胺含量测定结果,与野生型组相比,转基因模型组有降低趋势,但无统计学意义(P0.05);三七总皂苷组、栀子苷组和配伍组对转基因组的五羟色胺含量有升高趋势,但都没有统计学意义(P0.05)。(3)相关性分析结果,八臂迷宫测试中小鼠进入食物臂的时间百分比与血清中乙酰胆碱的含量成正相关(r=0.35,P0.05),与血清中五羟色胺的含量没有相关性(rs=0.16,P=0.39)。结论:三七、栀子有效组分及配伍给药对APP/PS1小鼠血清中乙酰胆碱的含量有调节作用,APP/PS1小鼠血清中乙酰胆碱的含量与八臂迷宫行为学测试体现的空间学习记忆能力成正相关。     

绞股蓝总皂苷对光老化人皮肤成纤维细胞凋亡及Caspase-3信号通路的影响

目的:探讨绞股蓝总皂苷(Gyp)对光老化人皮肤成纤维细胞(HSF细胞)凋亡以及Caspase-3信号通路的影响。方法:分别以80、160、320 mg/d剂量的Gyp生理盐水溶液灌胃大鼠7d后取血并分离血清,长波紫外线(UVA)照射方法(照射剂量36 J/cm3)构建光老化HSF细胞模型以得到低剂量组、中剂量组、高剂量组,同时以空白对照组(未照射细胞)、UVA模型组、正常组为对照。UVA诱导的细胞活性氧表达采用二氯荧光素(DCF)法测定,细胞凋亡情况采用TUNEL法测定,HSF细胞活性采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定,Bax、Bcl-2、Caspase-3基因和蛋白表达分别采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting方法进行测定。结果:与空白对照组比较,其余5组的OD值、HSF细胞凋亡数、活性氧(平均荧光强度)、活性氧水平、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平差异具有统计学意义(P0.05);与UVA模型组和正常组比较,低、中、高剂量组OD值、HSF细胞凋亡数、活性氧(平均荧光强度)、活性氧水平、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平差异具有统计学意义(P0.05);低、中、高剂量组随着剂量增加OD值、Bcl-2mRNA和蛋白表达水平逐渐升高,细胞凋亡数、活性氧(平均荧光强度)、活性氧水平、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平逐渐降低(P0.05)。结论:Gyp通过抑制细胞内活性氧的产生以及Bax的表达,以及激活Bcl-2、Caspase-3信号通路而逆转UVA诱导的HSF细胞凋亡,进而延缓HSF细胞的光老化现象。