具有a-淀粉酶分泌活性以及低双乙酰产量的啤酒酵母工程菌的构建

扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)因具有较强的a-淀粉酶以及葡聚糖酶活性, 使其在以淀粉为唯一碳源的培养基上能够良好的生长。从其基因组中克隆了a-淀粉酶的编码区, 构建了由酵母磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子、酿酒酵母a-因子信号序列以及扣囊复膜酵母a-淀粉酶基因编码序列组成的基因表达盒。将该表达盒插入到质粒pPLZ-2的ILV2基因序列内部, 使其两翼具有ILV2基因的同源区。将该表达盒通过同源重组的方式整合到啤酒酵母工业菌株YSF-5的a-乙酰乳酸合成酶(AHAS)基因ILV2内部。在以淀粉为唯一碳源的培养基上进行转化子的筛选。通过多对引物PCR、a-淀粉酶活性以及AHAS活性分析对转化子进行鉴定, 得到一株具有a-淀粉酶分泌表达活性、较低AHAS活性, 并且发酵液中双乙酰产量也相对较低的啤酒酵母工程菌。该菌株在非选择压力条件下连续培养50代后仍然保持其遗传稳定性。还对pH、温度以及金属离子对该转化菌株的a-淀粉酶活性的影响进行了研究。由于所构建的菌株不含有非酵母来源的DNA, 所以生物安全性相对较高, 对酵母育种以及啤酒生产工业都具有较为重要的意义。     

低双乙酰抗老化啤酒酵母工程菌的构建

用来源于啤酒酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和铜抗性基因（CUP1）取代质粒pLZ-2中α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）内部约2.3kb的DNA片段,构建成重组质粒pICG。限制酶酶切质粒pICG后获得在基因GSH1和CUP1两端含有ILV2序列的6.0kb的DNA片段。用此片段转化啤酒酵母YSF31,得到铜抗性高的转化子。并通过PCR和α-乙酰乳酸合成酶（AHAS）活性测定筛选到酵母工程菌。小试实验结果表明酵母工程菌谷胱甘肽含量比受体高34％,而双乙酰含量是受体的75％。其他发酵指标并没有发生改变。中试实验表明酵母工程菌发酵周期缩短3d,而且成品啤酒的保鲜时间延长50％。由于DNA操作过程中没有外源基因介入,因此啤酒酵母工程菌为生物安全的自克隆菌株,具有重要的实际应用价值。     

高SO2产量啤酒酵母工业菌株的构建

二氧化硫在啤酒中具有抗氧化的重要功能,而在其形成过程中APS激酶(MET14编码)起着非常重要的作用。以二氧化硫产量较高的青岛啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSF-5的总DNA为模板,用PCR方法克隆得到MET14基因。为使目的基因在酿酒酵母中表达,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以PGK1强启动子为调控元件,构建了重组表达质粒pPM,并转化酿酒酵母YS58。转化子在YNB添加亮氨酸、组氨酸和色氨酸的选择性培养基上筛选鉴定,盐酸副玫瑰苯胺法测得转化子的SO2产量是受体菌的2倍左右。在重组表达质粒pPM的基础上添加铜抗性标记基因构建了重组表达质粒pCPM,并转化青岛啤酒工业酵母菌株YSF-38,转化子在YEPD 4mmol/L CuSO4的选择性培养基上筛选鉴定,实验室条件下培养后,测得转化子YSF-38(pCPM)的SO2产量是受体菌的3.2倍。用该转化子在青岛啤酒厂进行小型发酵实验,结果表明在发酵结束时,YSF-38(pCPM)转化子的SO2产量是受体菌的1.4倍。因此,MET14基因的有效表达可以提高啤酒工业酵母的SO2产量。     

絮凝基因内衔接重复序列与酵母菌絮凝特性多样性及遗传稳定性

存在于酵母菌细胞表面的絮凝蛋白与邻近细胞表面寡聚甘露糖链相互作用,从而使细胞相互聚集形成细胞团的生理过程称为酵母菌絮凝。编码絮凝蛋白的基因中存在大量衔接重复序列,这些重复序列的变化不但使酵母菌呈现出絮凝特性的多样性,而且由重复序列驱动的基因内或基因间重组使酵母菌的絮凝特性具有非常明显的遗传不稳定性。文中综述了基因内重复序列对酵母菌絮凝特性和遗传稳定性的影响,将为基于序列调控策略改进酵母菌絮凝特性及遗传稳定性奠定理论基础,为絮凝特性在发酵工业或环境修复过程中的可控应用提供新的解决策略。     

酵母菌利用糖蜜发酵产麦角甾醇的工艺条件优化

麦角甾醇是由酵母菌产生的具有重要经济价值的代谢产物。为了提高酵母菌利用糖蜜发酵生产麦角甾醇的产量,通过响应面分析法优化了发酵培养基配方,并在5 L发酵罐对发酵过程pH控制和底物流加补料方式进行了优化。结果表明,利用优化后的发酵培养基,即糖蜜总糖40 g/L,KH2PO4 1 g/L,K2HPO4 1.86 g/L,CuSO4·5H2O 17.5 mg/L,FeSO4·7H2O 13.9 mg/L,MgSO4·5H2O 12.3 mg/L,玉米浆10 mL/L,麦角甾醇产量比优化前提高了29.5%;利用恒定pH控制策略,在5 L发酵罐进行分批发酵,使麦角甾醇产量提高了62.1%;进一步采用底物流加补料策略,使麦角甾醇产量达到1 953.85 mg/L,是分批发酵的3.2倍,而且麦角甾醇产率比分批发酵提高了42.7%。为酵母菌发酵糖蜜产麦角甾醇的产业化应用奠定了基础。     

甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到酵母菌甾醇C-22去饱和酶基因(ERG5)的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pYPE5。以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换ERG5基因内部序列获得ERG5破坏菌株YSE5,其中麦角甾醇的合成被阻断,而积累了甾醇中间体Ergosta-5,7-dien-3β-ol。表达质粒pYPE5转化破坏菌株后使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力。说明表达质粒上的ERG5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,通过营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定,发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌YS58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦角甾醇含量,发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见,ERG5在酵母中的高表达导致细胞麦角甾醇含量降低。     

酵母超氧物歧化酶高产菌的选育

采用常规筛选方法从300多株不同种属的酵母菌中筛选到两株细胞生物量和超氧物歧化酶(SOD)含量都较高的菌株(酿酒酵母,编号为Y-8和Y一111)作为实验出发菌.经单倍体分离、N-甲基-N-亚硝基-N’-硝基胍(MNNG)诱变和群体杂交等手段,从中选育出一株细胞生物量略高于实验出发菌、超氧物歧化酶高达1350U/g湿菌体的SOD高产菌株(编号为ZDF-48),它的SOD产量分别为实验出发菌株Y-8和Y-111的2.2 倍和2.4倍.经分离纯化后蛋白含量及超氧物歧化酶活性测定等研究,证明我们选育出的ZDF-48是一株生产超氧物歧化酶的优良品系.     

不同微生物的α-乙酰乳酸脱羧酶的生理生化特性的研究*

分析测定了不同微生物的α－乙酰乳酸脱羧酶（ＡＬＤＣ）酶活力，结果表明不同来源的ＡＬＤＣ酶活力有较大差异，酶反应速度曲线存在明显差异；酶反应体系的ｐＨ对ＡＬＤＣ酶活力有明显的影响，如乳酸乳球菌的ＡＬＤＣ酶反应最适ｐＨ为６．６，而产气气杆菌的ＡＬＤＣ酶反应的最适ｐＨ为５．８；酶反应体系中加入不同浓度的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸对不同来源的ＡＬＤＣ酶活性有较明显的影响。     

酵母菌絮凝的分型及其生理生化特性的研究

通过对410余株酵母菌进行絮凝测定,从中筛选到5株强絮凝菌。依据不同糖对其絮凝水平的抑制,将5株强絮凝菌分为Flo 1型和NewFlo型。对这两种絮凝型菌株的相关生理生化特性进行了研究。结果表明,Flo 1型菌絮凝只受甘露糖抑制,它对高温(70℃)、蛋白酶E、胰蛋白酶敏感,而对蛋白酶K、糜蛋白酶、Ca\+\{2+\}\,pH有一定耐受性。NewFlo型菌絮凝受甘露糖等多种糖抑制,它对高温(70℃)、各种蛋白酶、Ca\+\{2+\}、pH均较敏感。这两种类型菌株絮凝的最适Ca\+\{2+\}浓度为10mmol/L～1mol/L,最适pH为3.0～45。     

酵母菌的载体系统研究进展

由于酵母菌特别是酿酒酵母是单细胞生物,具生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等优点,被认为是表达外源蛋白的最适受体菌。随着重组DNA技术的发展,酿母菌的转化和载体系统的研究已取得很大的进展,已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在酿酒酵母中克隆和表达,已应用酵母工程菌来生产一些重要的外源蛋白,并显示出巨大的优越性。本文着重介绍酵母菌载体系统的研究进展。根据其在酵母菌遗传工程中的应用,可将酵母菌载体系统分为普通的克隆载体和特殊用途的载体两大类。回酵母菌的克隆载体依据…