融合表达氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE合成L-别异亮氨酸

【背景】L-异亮氨酸(L-isoleucine,L-Ile)和L-别异亮氨酸(L-allo-isoleucine,L-allo-Ile)是自然界中广泛存在的一对同分异构体。抗感染抗生素Desotamides结构中含L-别异亮氨酸结构单元,其生物合成途径中的氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE可以协作催化L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸相互转化。【目的】通过理性设计,使氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE融合表达,研究融合蛋白DsaDE催化异亮氨酸和别异亮氨酸相互转化的功能。【方法】利用PCR分别扩增dsaE基因编码区DNA片段、以及含dsaD基因编码区和114个碱基接头序列的DNA片段dsaD-linker,利用酶切位点KpnI将dsaE和dsaD-linker相连,形成das DE重组序列,并克隆至pET28a(+)中,将重组质粒pET28a-dsaDE转化至Escherichia coli BL21(DE3)中进行融合表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白DsaDE;分别以L-异亮氨酸和L-别异亮氨酸为底物进行融合蛋白的体外酶活性检测,利用高效液相色谱对酶反应产物进行分析。【结果】PCR验证、酶切验证以及测序结果证明pET28a-dsaDE重组载体具有正确序列;N-末端和C-末端融合6个组氨酸标签的融合蛋白DsaDE在E. coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法一步纯化获得纯度约95%的融合蛋白,纯化的融合蛋白DsaDE具有较好的活性,能够催化L-isoleucine和L-allo-isoleucine间的相互转化。【结论】氨基转移酶DsaD和异构酶DsaE成功融合表达,经一步Ni-NTA亲和层析法纯化即可获得纯度较高的融合蛋白,融合蛋白同时具有氨基转移酶和异构酶的活性,为进一步研究L-别异亮氨酸的工业化生产奠定了基础。     

珊瑚礁白化研究进展

珊瑚礁白化是由于珊瑚失去体内共生的虫黄藻和（或）共生的虫黄藻失去体内色素而导致五彩缤纷的珊瑚礁变白的生态现象。近年来，频繁发生的珊瑚礁白化导致了珊瑚礁生态系统严重退化，并已经影响到全球珊瑚礁生态系统的平衡，受到了人们的高度重视。研究认为：（1）大范围珊瑚礁白化主要是全球环境变化引起的，尤其是全球变暖和紫外辐射增强；（2）导致珊瑚礁白化的机制主要在于细胞机制和光抑制机制；（3）珊瑚礁白化后的恢复与白化程度有关，大范围白化的珊瑚礁完全恢复需要几年到几十年；（4）珊瑚礁白化的后果在于降低珊瑚繁殖能力、减缓珊瑚礁生长、改变礁栖生物的群落结构，导致大面积珊瑚死亡和改变珊瑚礁生态类型，如变为海藻型等；（5）与珊瑚共生的D系群虫黄藻更适应高温环境，珊瑚礁有可能通过D系群逐渐取代C系群的方式适应全球环境变化。     

海洋固氮菌和解磷菌的分离鉴定及发酵条件优化

【目的】从西沙喜盐草根际沉积物中分离纯化得到具有高效固氮能力及解磷能力的菌株。优化其发酵培养条件,研究其制备海洋微生物菌剂的可能性。【方法】从形态学特征、生理生化、16S rDNA及功能基因水平进行鉴定,通过乙炔还原法、钼锑抗显色法检测菌株的固氮酶活性和解磷能力,单因素法和响应面法优化其发酵培养条件,溶血试验和急性毒性实验鉴定菌株的安全性。【结果】结果表明,菌株AZ16属于星箭头菌(Sagittula stellate),革兰氏阴性菌,选择性固氮培养基中菌落呈黄圆形黏稠状,固氮酶活性达34.63 nmol C2H2/(mL·h),最适生长条件为:盐度25‰、pH 7.5、温度33°C、接种量5.0%;菌株XT37为海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.),革兰氏阳性菌,选择性固氮培养基中菌落呈深黄色圆形褶皱,植酸酶活性达239.49μg/L,最适合生长条件为:盐度25‰、pH 6.7、温度28°C、接种量5.0%。溶血实验和急性毒性实验证明两株菌属实际无毒级别。【结论】两株菌具有高效的固氮解磷功能,以及抗高盐、强碱等环境的能力,安全无毒,因此有潜力应用于多功能混合微生物菌剂的研制。     

大型海藻在珊瑚礁退化过程中的作用

随着全球范围珊瑚礁的退化,大型海藻在珊瑚礁区的覆盖度呈增多的趋势。大型海藻的大量生长,妨碍了珊瑚的生长、繁殖、恢复等过程。概括起来,大型海藻对珊瑚生长、繁殖及恢复过程所产生的不利影响主要包括:(1)大型海藻通过与珊瑚竞争空间和光照而影响珊瑚生长;(2)大型海藻与珊瑚直接接触时,通过摩擦作用及释放化感物质而影响珊瑚生长;(3)大型海藻的大量生长打破了珊瑚与海藻的竞争平衡,珊瑚为应对大型海藻的入侵而把用于生长和繁殖的能量转移到组织修复与防御上,进而造成珊瑚繁殖能量的减少;(4)大型海藻通过影响珊瑚幼虫的附着及附着后的存活率,而阻碍珊瑚群落的发展;(5)海藻还能通过富集沉积物、释放病原体及扰乱珊瑚共生微生物的生长等而间接影响珊瑚生长。明确的竞争机制有利于研究海藻与珊瑚的相互作用过程。在总结前人对海藻与珊瑚的竞争机制研究的基础上,把两者的竞争机制划分成物理机制、化学机制、微生物机制三大类,物理机制是研究得比较透彻的竞争机制,而化学机制与微生物机制则需要更深入的研究,是当前研究的热点。目前,我国对珊瑚礁中底栖海藻与珊瑚的相互作用研究甚少;鉴于此,对底栖海藻功能群的划分类型以及三大类型底栖海藻对珊瑚的作用特点做了简要介绍,并对珊瑚礁退化的现状和退化珊瑚礁区内海藻的表现做了概述。在此基础上,再综述国外关于大型海藻对珊瑚的影响研究进展,指出我国应该加强对南海珊瑚礁区大型海藻的种类分布及丰富度等的调查,评价大型海藻对南海珊瑚礁的影响现状;并结合生理学、分子生物学技术和生态学研究手段,在细胞与分子水平上探索海藻对珊瑚的影响机制,以期为珊瑚礁生态系统的保护提供参考。     

一种新融合抗菌肽Hex-Mag基因的克隆、表达及其抗菌活性的研究

通过在Magainin1-12(GIGKFLHSAKKF)的N端添加碱性氨基酸片段Hexapeptide(RRWQWR)以增强其对细胞膜的吸附能力来提高Magainin1-12的抗菌活性。利用Hexapeptide和Magainin1-12的基因序列,结合酵母偏爱密码子设计出新的融合基因Hex-Mag,通过重叠区扩增基因拼接法(Gene splicing by overlap extension,gene SOEing)利用PCR扩增出基因片段,再将融合基因进行酶切并纯化后导入穿梭质粒pPIC9中,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)的启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115毕赤酵母宿主菌,经表型筛选,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达出的融合肽Hex-Mag分子量约2.3kDa,其耐热性强,在100℃条件下,其活性可维持3h以上。琼脂糖孔穴扩散法检测显示Hex-Mag对多种革兰氏阴性菌和阳性菌具有抑制活性,与Magainin1-12相比,其活性有明显增强,N端正电荷增加的预期效应得到初步体现。     

海洋污损生物数据管理系统的设计与构建

固着或栖息在船舶和人工设施水下部位的海洋污损生物, 会对人们的涉海活动产生不利影响, 其群落的形成和发展过程与温度、盐度、深度、季节、海域、浸海时间、离岸距离和附着基类型等多种因素密切相关。为便于系统分析和综合处理各海区污损生物资料, 理清各要素之间的内在关系, 需要一个能将上述因子与生物群落参数有机地结合起来的数据平台, 将分散、零星的资料予以归纳整合并通过网络共享, 以更好地为生产实践和科学研究服务。本研究采用Internet技术, 应用ASP.NET框架和MySQL数据库, 使用MS Visual Studio 2013设计并开发了服务端部署在Windows 7或Windows Server 2008 R2 (推荐)操作系统上的海洋污损生物数据管理系统, 实现了基于网络的海洋污损生物数据集成、储存与管理, 可完成来源不同、时相变化和海区多样的污损生物数据资料的集成与储存, 能通过单一或多种组合条件进行查询和检索, 并可根据用户的需要导出多种格式的检索结果报表。该系统具备操作简便、方便网络共享、易于升级更新和开拓新功能等特点, 能有效满足科研、生产和管理部门的需要。     

我国环境影响评价中存在问题及对策研究进展

中国于2003 年9 月开始实施环境影响评价法, 该法的实施有效遏制了国家日益恶化的环境状况, 在科学地预见环境问题、有效防止环境污染等方面起到了积极的作用。然而, 目前的环境影响评价(EIA)体系尚不够完备, 在EIA涉及的范围、时间、内容及导则等方面存在一些制度的缺失。文章分析了环境影响评价实践中存在的主要问题, 提出了相应的改进建议, 包括拓展EIA 的范围, 加强政府部门的协调, 统一环评的时间点, 强化EIA 技术导则中的替代方案内容等, 制定更符合我国国情的EIA 技术导则。此外, 根据目前EIA 状况, 对其今后的发展方向做了预测。     

南海深海微生物酯酶EST12-7在制备(R)-2-氯丙酸乙酯中的应用研究

利用来源南海深海的微生物酯酶EST12-7不对称水解反应拆分制备（R）-2-氯丙酸乙酯。并探寻了温度、pH、底物浓度、有机溶剂和反应时间等因素对酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的影响。结果表明,深海微生物酯酶EST12-7催化制备（R）-2-氯丙酸乙酯的最佳反应条件为：13.8 μg/ml酯酶EST12-7,50 mmol/L（±）-2-氯丙酸乙酯,2%正癸醇,pH8.5,30℃,0.05mol/L Tris-HCl,反应60 min。在最佳反应条件下,（±）-2-氯丙酸乙酯的转化率可达49%,所制备的（R）-2-氯丙酸乙酯的光学纯度为98%。通过对酯酶EST12-7拆分制备（R）-2-氯丙酸甲酯和（R）-2-氯丙酸乙酯进行比较,2-氯丙酸酯中的链长对酯酶EST12-7拆分反应有极大的影响。     

自组织特征映射神经网络识别珠江口夏季水质空间格局

通过建立珠江口2009 年夏季水质综合评价的自组织特征映射网络模型, 探索了珠江口不同河段水质状况。结果表明, 利用自组织特征映射网络人工神经网络可以直观清晰地对珠江口海域水质空间进行分类。珠江口海域水质可分为三大类, 第一类为受到人类活动影响显著的广州河段区域; 第二类为内伶仃洋海域, 该区域主要受到咸淡水混合的影响; 第三类为主要受到外海水交换影响的外伶仃洋海域。结果阐明人工神经网络模型能为珠江口环境保护与生物资源可持续利用提供科学的决策依据。     

红树植物桐花树 E F1 A 基因的克隆与表达分析

通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。