yhcZ基因在苏云金芽胞杆菌生长中的功能研究

在枯草芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌中,yhcZ基因和yhcY基因组成双组分系统调控细菌生长,但yhcZ基因在苏云金芽胞杆菌中发挥的生物学功能尚未明确。本研究通过基因功能注释、上下游基因排列分析和氨基酸序列比对,证实苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种HD73中HD73_5824基因为yhcZ基因,推测其与HD73_5825基因(yhcY基因)共同组成双组份系统调控细菌生长。利用同源重组技术敲除HD73菌株中的yhcZ基因获得缺失突变体HD (ΔyhcZ),其在LB和SSM培养基中生长均慢于野生型HD73,而互补菌株HD(ΔyhcZ::yhcZ)菌株则能够部分恢复生长,表明yhcZ基因的缺失影响了该菌株细胞的生长。在以0.4%葡萄糖为唯一碳源的M9培养基中,HD (ΔyhcZ)生长速度快于HD73,表明yhcZ基因在该菌株吸收利用葡萄糖的过程中发挥重要作用。Biolog实验显示HD (ΔyhcZ)的单孔颜色变化率低于HD73,且对D/L-丝氨酸、甲酸、D-葡糖酸、L-组胺,D-乳酸甲酯以及柠檬酸等的吸收利用能力低于HD73,表明yhcZ基因能显著影响HD73菌株对碳源的利用。同时,HD(ΔyhcZ)对8% NaCl的耐受能力弱于HD73,表明该基因可能参与细菌细胞应力响应相关基因的表达与调控。以上结果表明yhcZ基因在HD73菌株生长过程中对葡萄糖及其他碳源的利用具有重要的促进作用。本研究结果为解析yhcZ基因调控葡萄糖及碳源利用的分子机制奠定基础,且为进一步研究细菌生长及发酵提供参考。     

麦红吸浆虫唾腺EST-SSRs的信息分析及分子标记筛选

昆虫EST资源库的扩充为开发新的分子标记提供了宝贵的资源。本研究对NCBI的EST数据库中来源于麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana唾腺的1 217条EST序列进行了unigene组装、 SSR信息分析和EST-SSR分子标记筛选。结果表明： 在1 047个unigenes中共找到141个SSR位点, 分布于106个（10.12%）unigenes中, 平均每3.49 kb出现一个SSR位点。在1~6碱基重复基元中, 1~3碱基是主要重复类型, 占总SSR的97.16%以上。A/T（31.21%）, AC/GT（15.60%）和AAC/GTT（9.22%）分别是单、 双和三碱基中占优势的重复基元类型。利用Primer Premier 5.0软件对查找的EST SSRs进行引物设计, 并以麦红吸浆虫基因组DNA为模板, 对从中选出的26对SSR引物进行多态性检测。结果有20对（76.92%）引物能扩增出清晰的目的条带, 并且其中9对（45%）引物表现出多态性。多态性分析结果表明, 从9对EST-SSR引物中, 共检测到51个等位基因, 平均每个位点含有等位基因数为5.67, 平均期望杂合度为0.65, 平均多态信息含量为0.60。本研究能够为今后麦红吸浆虫的种群遗传结构与遗传多样性研究提供帮助。     

粘虫类钙粘蛋白基因的克隆、序列分析及时空表达

昆虫中肠膜类钙粘蛋白（cadherin-like protein, CLP）是苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis (Bt)毒素的重要受体之一, 与Bt毒素的杀虫作用机制以及昆虫对Bt毒素的抗性等密切相关。本研究应用RT-PCR和RACE技术, 克隆了迁飞性重要害虫粘虫Mythimna separata类钙粘蛋白基因全长cDNA序列（命名为Msclp, GenBank登录号为JF951432）, 全长5 642 bp, 编码1 757个氨基酸, 推导的氨基酸序列具有昆虫类钙粘蛋白的特征结构, 包括1个信号肽、 1个前蛋白区、 12个钙粘蛋白重复、 1个近膜区、 1个跨膜区和1个胞质区。预测的分子量和等电点分别为196.786 kD和4.5。该蛋白与同科的烟夜蛾Helicoverpa assulta、 烟芽夜蛾Heliothis virescens、 棉铃虫Helicoverpa armigera及甜菜夜蛾Spodoptera exigua的类钙粘蛋白亲缘关系最近, 氨基酸序列一致性分别为61.77%, 61.66%, 61.26%和58.14%。荧光定量RT-PCR分析表明, 该类钙粘蛋白基因在不同龄期的粘虫幼虫中表达量差异极显著(P<0.01), 其中4龄幼虫相对表达量最高, 但与3龄、 6龄幼虫并没有显著性差异; 1和2龄幼虫表达量最低; 表达部位主要在粘虫中肠, 在中肠以外的虫体其他部位表达量极低。这些结果对于揭示转Bt作物对非靶标、 迁飞性粘虫的杀虫作用机制以及评价其潜在的对Bt毒素抗性机制等奠定了基础。     

田间转Bt基因水稻上稻飞虱卵量、孵化率及天敌作用

为了评估转基因水稻释放后对非靶标害虫及其天敌的影响, 本研究在浙江大学实验农场和中国水稻研究所实验农场2008和2009年连续两年监测了转Bt基因水稻对田间稻飞虱着卵量、卵孵化率、卵被捕食率、卵被寄生率和卵死亡率的影响。结果表明: 两年2个调查地点3个水稻品系（克螟稻1、克螟稻2和秀水11）上的稻飞虱平均每分蘖着卵量、卵孵化率、卵被捕食率和卵被寄生率的趋势基本一致, 而且田间3个水稻品系上稻飞虱卵量的高峰期均持续2周左右; 但是两年2个调查地点3个水稻品系上稻飞虱卵死亡率则没有一致的趋势。此外, 总体上3个水稻品系上稻飞虱平均每分蘖着卵量、卵孵化率、卵被捕食率、卵被寄生率和卵死亡率差异均不显著（P>0.05）。因此, 稻田中转Bt基因水稻对稻飞虱卵没有显著的影响。     

草地螟普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）蛋白表达纯化及结合特性分析

气味结合蛋白在昆虫对寄主挥发性气味识别过程中有着重要的生理功能。本研究通过对草地螟Loxostege sticticalis L. 普通气味结合蛋白Ⅰ（Lsti-GOBP1）进行克隆及原核表达的基础上, 分离纯化得到体外重组的Lsti-GOBP1蛋白。并利用N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine, 1-NPN）作为荧光探针研究了Lsti-GOBP1蛋白与醇类、 醛类、 酯、 烯等50种气味标样的结合特性, 结果表明Lsti-GOBP1可与其中35种气味化合物结合, 但只有1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛和莰烯4种气味标样能在20 μmol/L浓度（探针与蛋白结合的饱和浓度值）下将1-NPN从Lsti-GOBP1中替换50%, 其结合常数分别为8.997, 7.283, 7.289 和9.814 μmol/L。据此可以得出, Lsti-GOBP1蛋白的气味物质结合谱很广, 同时具有较强的特异性, 其中1-己醇、 1-庚醇、 肉桂醛、 莰烯等化合物在草地螟识别寄主植物气味物质的过程中起重要作用。     

环境因子对沟金针虫呼吸代谢的影响

为了探讨沟金针虫Pleonomus canaliculatus对不同环境条件的适应性, 应用多通道昆虫呼吸仪测定了不同温度、O₂浓度、光照强度和湿度条件下沟金针虫的呼吸率。结果显示: 沟金针虫的呼吸模式为不规则波动型。温度和光照强度对沟金针虫的CO₂释放率影响突出, 不同处理间差异显著; 不同温度条件下, CO₂释放率最小和最大值分别为5℃时的7.22 μL/h和35℃时的180.74 μL/h, 两者间存在极显著差异（P<0.01）; 强光条件下的沟金针虫呼吸代谢强度大约是无光条件下的2倍（P<0.05）。不同的O₂浓度和空气相对湿度对沟金针虫的CO₂释放率无明显影响。同时确定了沟金针虫呼吸速率对温度的敏感性——Q₁₀值。结果表明沟金针虫在呼吸代谢过程中对温度和光照反应敏感, 对低氧和湿度环境的适应性较强。     

甜菜夜蛾HSP90基因克隆及高温胁迫下其表达量的变化

为阐明热激蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）在甜菜夜蛾Spodoptera exigua (Hübner)幼虫抵抗高温过程中的作用, 克隆了其HSP90基因cDNA全长序列, 并检测了在系列高温胁迫下不同龄期幼虫体内其相对表达量。根据已报道的热激蛋白90基因序列同源性设计简并引物, 利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了甜菜夜蛾HSP90基因全长cDNA（GenBank登录号FJ862050）。该cDNA序列开放阅读框长2 154 bp, 编码717个氨基酸, 预测的相对分子量和等电点分别为82.6 kD和5.0。该序列具有HSP90家族的典型特征和特殊的功能结构域, 并且与多种生物的HSP90基因序列有较高的同源性。为了研究HSP90抵抗高温的作用, 构建荧光定量RT-PCR体系, 检测了37, 39, 41, 43和45℃胁迫下甜菜夜蛾不同龄期幼虫体内HSP90表达量的变化。结果表明, 高温胁迫对甜菜夜蛾幼虫体内的HSP90表达具有明显的诱导作用。幼虫体内HSP90表达量随着温度升高呈增加的趋势。43℃和45℃胁迫下, 各龄幼虫体内HSP90的表达量均显著高于常温（P< 0.05）, 但不同龄期之间没有显著差异。这说明HSP90在甜菜夜蛾幼虫抗高温中起到重要作用。     

褐飞虱EST资源的微卫星信息分析

表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）是开发微卫星标记的一个重要的资源。褐飞虱Nilaparvata lugens （Stål） EST序列的公布为开发EST-SSRs提供了宝贵的数据资源,本研究利用生物信息学对NCBI公共数据库中的37 398条褐飞虱ESTs序列进行EST-SSRs特征分析,得到全长为7 619 324 kb的无冗余EST 9 852条。按照3个不同的查找标准在这些序列中搜索SSR。查找结果显示：褐飞虱EST-SSRs主要重复基元以1～3碱基为主,占总EST-SSR的95％以上。在单碱基重复基元中,A/T是占优势的重复基元,在二相重复类型中,AG/CT重复基元出现的频率最多,而AAG/CTT是三相重复中占绝对优势的重复基元。在褐飞虱EST-SSRs中未查找到GC重复基元。以100 bp为参照,在3种查找标准下含有SSR的EST序列中两端侧翼序列均≥100 bp的序列分别为738,89和42个。通过分析褐飞虱EST-SSRs标记可以为褐飞虱和近缘种的SSR标记的开发提供信息,同时通过分析褐飞虱EST-SSRs的分布频率和分布特征可以为昆虫EST-SSRs的研究提供借鉴和参考。     

苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1的克隆及表达谱分析

有证据表明昆虫气味结合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)与其嗅觉识别密切相关,起着运输外界脂溶性气味分子通过嗅觉感器淋巴液到达嗅觉受体的关键作用.为了更好地了解OBPs在苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus (Goeze)嗅觉识别中的作用,本研究首次克隆了苜蓿盲蝽气味结合蛋白基因Alin-OBP1 (GenBank序列号GQ477022). 测序和序列分析结果表明,该基因开放阅读框长438 bp, 编码145个氨基酸,预测分子量为15.69 kDa,等电点为5.01,N-末端疏水区包含由18个氨基酸组成的信号肽.蛋白特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸残基.利用RT-PCR和Real-time PCR技术对Alin OBP1在苜蓿盲蝽成虫不同组织和各个发育阶段的表达水平进行了测定,结果显示Alin-OBP1几乎全部在触角中表达.不同发育阶段Alin-OBP1表达量不同,在5龄若虫和成虫阶段表达水平最高.结果提示Alin-OBP1可能在苜蓿盲蝽感受包括性信息素在内的外界化合物的过程中发挥着重要作用.