真核细胞顺乌头酸酶活性检测新技术——胶内酶活性分析法

顺乌头酸酶（aconitase,Aco）是细胞内重要的铁硫蛋白酶,它催化细胞内柠檬酸经中间产物顺乌头酸生成异柠檬酸. 真核细胞中顺乌头酸酶有两种,分别定位在细胞质的顺乌头酸酶1（c-Aco）和定位在线粒体的顺乌头酸酶2（m-Aco）.检测它们活性的变化能敏感地反映出细胞中能量代谢、自由基产生、铁硫簇组装及铁代谢水平的改变. 顺乌头酸酶活性的传统检测方法通常是测定细胞中总的顺乌头酸酶活性,该方法难以准确区分出c-Aco和m-Aco各自的活性变化.因此我们建立一种胶内酶活性分析法检测顺乌头酸酶活性. 该方法利用非变性电泳技术将c-Aco和m-Aco浓缩分离,通过泡染底物显色,条带颜色深浅反映了酶活性的强弱. 同时,比较了胶内酶活性分析法和分光光度法检测细胞内c-Aco和m-Aco的活性,并对比检测了过氧化氢处理细胞前后Aco活性的变化.结果显示,这两种方法均可敏感地检测出Aco的活性改变,并有广泛的细胞系实用性,但胶内酶活性分析法可区别测定c-Aco和m-Aco活性,不需繁琐的细胞质和线粒体分离,简便易行.文中介绍的线粒体分离纯化技术也为线粒体功能深入研究提供了一个快速、高效的分离纯化方法.     

靶向抑制铜伴侣蛋白CCS逆转卵巢癌C13*细胞的顺铂耐药性

顺铂（cisplatin）,即二胺二氯铂/diaminedichloroplatinum（DDP）,是治疗卵巢癌最有效的化疗药物;然而,耐药性是限制顺铂临床治疗效果的最重要因素。目前,卵巢癌对顺铂的耐药机制仍不十分清楚。超氧化物歧化酶1铜伴侣蛋白（copper chaperone for superoxide dismutase 1, CCS）介导Cu2+特异性传递给超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase1, SOD1）,为维持细胞增殖和生存所必需;相反,抑制CCS可减缓肿瘤细胞增殖。本研究旨在证明,AMPK依赖的CCS表达与卵巢癌的顺铂耐药有关。实时定量PCR及免疫印迹结果显示,与顺铂敏感细胞株OV2008比较,顺铂耐药细胞株C13*中的CCS mRNA和蛋白质表达水平明显上调。shRNA靶向沉默CCS或采用抑制剂DC_AC50抑制CCS后,可明显增强顺铂对C13*细胞增殖的抑制作用,提示CCS高表达与顺铂耐药相关,而抑制CCS可逆转顺铂的耐药性。同样,免疫印迹结果证明,CCS在A549、H1944等6种不同肺癌细胞中的表达水平高低与顺铂敏感性密切相关。采用siRNA干扰CCS在A549细胞中的高表达,或在CCS低表达的H1944细胞中过表达CCS,可明显增加A549或减弱H1944细胞对顺铂的敏感性,进一步证明CCS表达与顺铂耐药性相关。此外,采用AMPK抑制剂化合物C阻断AMPKα Thr172磷酸化（激活）,即抑制AMPK信号通路,可明显抑制CCS在C13*细胞中的表达,提高其对顺铂的敏感性。以上研究结果提示,AMPK信号通路依赖的CCS表达参与肿瘤的顺铂耐药机制,而抑制CCS逆转顺铂耐药。本文的结果还提示,CCS有望成为克服顺铂耐药的潜在靶点。     

顺铂靶向食管癌细胞周期Cx43表达的研究

目的:为研究顺铂治疗食管鳞癌细胞的靶向作用。方法:本研究使用流式细胞技术双变量分析检测顺铂对食管癌细胞周期进程和癌细胞周期的连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。结果:顺铂对食管鳞癌细胞周期的影响主要作用于S期的DNA复制,细胞阻滞于S期,G2/M期减少。顺铂诱导食管鳞癌细胞周期S和G2/M期的Cx43表达的大幅度改变。低浓度顺铂(由0~2μmol/L),Cx43表达增强;顺铂渐高浓度(2~12μmol/L),细胞Cx43表达由强逐渐变弱,特别是G2/M期细胞的Cx43表达活跃,易受顺铂影响。结论:我们的研究表明以顺铂处理食管鳞癌细胞,癌细胞周期的S期和G2/M期的Cx43表达与S期的DNA复制一样可作为的潜在治疗靶标。顺铂靶向作用细胞周期S和/或G2/M期细胞的特性可能减少或避免对非分裂细胞的影响。     

叶酸靶向载顺铂羧甲基-β-环糊精纳米复合物的制备及对鼻咽癌的体外抑制效应

为达到鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NeC）的靶向化疗,该研究通过酰胺化反应和配位偶联技术制备叶酸（folicacid,FA）分子靶向载川页铂（cisplatin,CDDP）羧甲基-β-环糊精（carboxymethyl-β-cyclodextrin,CM—β—CD）纳米复合物（FA-CM—β—CD—CDDP）,采用邻苯二胺（o-phenylenediamine,OPDA）比色法检测复合物中CDDP含量,紫外分光光谱检测FA含量,透射电镜观察复合物形态,激光粒度仪测定复合物粒径大小。荧光显微镜观察NPC叶酸受体（folatereceptor,FR）阳性HNE-1细胞及FR阴性CNE-2细胞对偶联FITC的复合物的吞噬及OPDA比色法检测细胞内CDDP的浓度。通过MTT法、集落形成实验和流式细胞术检测复合物对HNE-1细胞增殖能力和凋亡的影响。研究结果显示,复合物中偶联的FA和CDDP浓度分别为340gg／mL和2mg／mL,CDDP包封率达20．00％,复合物粒径均匀且大小为157．8nm。HNE-1细胞内见较多FITC,细胞内CDDP浓度为6．24ng／mL,而CNE-2细胞内FITC较少,细胞内CDDP浓度仅约2．01ng／mL。HNE-1生长抑制率在24h明显高于对照组（CM—β—CD—CDDP）,其IC50（4．80μg／mL）明显低于对照组（6．97μg／mL）,但当所载的CDDP终浓度达到16．00μg／mL时,两组抑制率均达到80％以上;作用48h两组抑制率无明显差异。在24h,当复合物的CDDP终浓度为1．00μg／mL时,HNE—1的集落形成率为33．21％,明显低于对照组（52．27％）。当复合物的CDDP终浓度为0．25μg／mL和1．00μg／mL时,HNE-1的凋亡率分别达12．65％和22．35％,明显高于对照组（6．91％和14.21％）。研究结果表明,成功构建的FA—CM—β—CD．cDDP纳米复合物能够靶向抑制FR阳性的NPC细胞增殖并促进其凋亡。     

奈达铂的临床应用新进展

奈达铂是铂类第二代抗肿瘤药物,临床研究表明奈达铂对大部分实体瘤,如头颈部肿瘤、食管癌、肺癌、卵巢上皮癌和宫颈癌等有效,其可联合多种化疗药物并具有放疗增敏作用。并可作为新辅助化疗应用在癌症术前治疗中。奈达铂的抗肿瘤作用优于顺铂,并且毒性谱有差异。主要不良反应如恶心呕吐发生率明显低于顺铂,联合放疗治疗中晚期癌症能提高有效率及生存率,明显减轻不良。值得临床进一步推广。依据NDP的临床前研究及临床应用,本文就奈达铂在临床上的应用作一简要综述。     

替吉奥治疗结肠癌的研究

目的：探讨替吉奥治疗结肠癌的疗效。方法：75例经病理组织学确诊的结肠癌患者,分为A、B、C组。A组：替吉奥联合奥沙利铂（艾恒）25例。B组：5-Fu／LV联合奥沙利铂（艾恒）25例。C组：替吉奥单药治疗25例。观察疗效、疾病控制率及不良反应。结果：A组、C组与B组对比,不良反应发生率明显降低。A组有效率48％,疾病控制率88％。B组有效率28％,疾病控制率84％。C组有效率32％,疾病控制率80％。结论：替吉奥是结肠癌辅助化疗联合用药及单药治疗老年结直肠癌较好的治疗药物。     

奈达铂联合调强放疗对局部晚期鼻咽癌的疗效的作用分析 *

摘要 目的： 分析奈达铂联合强调放疗在局部晚期鼻咽癌患者中的疗效。方法： 选择我院局部晚期鼻咽癌患者 87 例, 随机分为两 个组, 分别是奈达铂组 （ A 组） 和顺铂组 （B 组 ） ,对两组患者接受治疗后的近期疗效、 远期疗效以及毒性反应进行比较分析。结果： A、 B 两组患者鼻咽原发灶完全缓解 （CR ） 率分别为 91.8%、 86.8% （ P=0.632>0.05 ）, 颈部淋巴结转移灶的完全缓解 （CR ） 率分别为 87.8%、 84.2% （ P=0.864>0.05 ）, 均不存在统计学显著性差异。A、 B 两组患者 3 年的总生存率 （ OS ） 分别为： 81.6%、 78.9%, P=0.762; 局部控制率 （ LC ） 分别为： 93.9%、 94.7%, P=0.890; 两组患者 3 年的区域控制率 （RC ） 分别为： 98.0%、 97.3%, P=0.849; 两组患者 3 年 的无远处转移生存率 （DMFS ） 分别为： 79.6%、 76.3%, P= 0.724。A 组患者 Plt 下降发生率为 46.9%显著高于 B 组发生率 34.2% （ P<0.05 ）, 具有统计学显著性差异; A 组患者恶心呕吐的发生率 36.7%显著低于 B 组患者的发生率 76.3% （ P<0.05 ）, 具有统计学显 著性差异; 其余毒性反应的发生率均不存在统计学显著性差异 （P>0.05 ）。结论： 奈达铂联合强调放疗治疗局部晚期鼻咽癌的近期 疗效与远期疗效与顺铂相当, 但是奈达铂胃肠道不良反应发生率较顺铂低, 血小板的降低程度比顺铂更加严重。     

PB 方案在宫颈癌介入化疗中的疗效观察 及对Wee1 表达的影响

目的：研究PB 方案(顺铂DDP、博莱霉素BLM),并了解其对Wee1 蛋白表达的影响。方法：1、用PB方案对64 例ⅠB～ⅡB 期宫颈癌病人进行介入化疗,观察化疗前后宫颈肿瘤体积变化及化疗后反应,评价介入化疗的效果。2、比较介入化疗后手术患者 （观察组）与直接手术患者（对照组）术中情况及术后病理情况,评价介入化疗的近期疗效。3、测定介入前后Wee1 表达的变化,及 与临床病理的关系,了解PB方案对Wee1 的影响。结果：PB 方案介入化疗的有效率(CR + PR)为87.5% ,缓解率为96.9%,34.4% 出现了发热反应,未见其他明显不良反应。试验组和对照组手术时间分别为（2.92 ± 0.3）h 和（3.28 ± 0.55）h,术中出血量分别为 （453.1 ± 131.9）mL和（542.8 ± 5.6）mL,两组在手术时间和术中出血量方面差异有统计学意义（P ＜0.05),两组术后在盆腔淋巴结 转移、脉管浸润、宫旁浸润及阴道切缘受累方面差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。PB 方案介入化疗后,Wee1 的表达较介入化疗前 显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05),和临床分期、病理类型、淋巴结转移及病理分级无关,差异无统计学意义（P＞0.05)。结 论：PB介入化疗方案有效、低毒,对ⅠB～ⅡB期宫颈癌治疗具有较好的疗效,PB 方案是值得推广的介入化疗方案,Wee1 蛋白有 望成为监测PB 方案介入化疗疗效的指标。     

培美曲塞联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的临床疗效观察

目的:探讨培美曲塞联合顺铂治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的临床疗效。方法:随机选取我院肿瘤科晚期NSCLC患者177例,随机将其分为3组,培美曲塞联合顺铂治疗(PP组)72例,多西他赛联合顺铂治疗(DP组)53例,吉西他滨联合顺铂治疗(GP组)52例,比较三组治疗方法的临床疗效与不良反应之间的差异,根据临床疗效将PP组分为有效组与无效组,分析培美曲塞联合顺铂治疗晚期NSCLC的影响因素。结果:PP组疾病控制率(DCR)与客观有效率(ORR)均显著高于GP组(均P0.05);PP组与DP组近期疗效之间的比较无显著差异(均P0.05)。PP组的药物毒副作用均显著优于DP组与GP组(均P0.05)。PP组的中位生存期显著高于DP组与GP组(均P0.05),在无吸烟、腺癌与IV期晚期NSCLC患者中,培美曲塞联合顺铂治疗有效率更高。结论:培美曲塞治疗晚期NSCLC的疗效佳,与多西他赛相当并显著优于吉西他滨治疗,药物毒副作用小,且受吸烟状况、病理类型与临床分期影响。     

TGF-β1经DNMT1调控肺癌A549细胞对顺铂的敏感性

转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)与肿瘤的发生、发展以及凋亡关系密切,DNA甲基化关键酶DNMTs(DNA methyltransferases)在肿瘤发生及耐药中发挥重要作用,SPARC(secreted protein acidic and rich in cysteine)常因异常甲基化而表达下调。为探究肺癌对顺铂耐受的分子机制,该研究以肺腺癌A549细胞为研究对象,通过外源TGF-β1作用A549细胞,利用RT-PCR检测TGF-β1作用后DNMTs和SPARC m RNA水平的变化以及A549细胞增殖能力和对顺铂敏感性的影响。结果显示:5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用24 h后,A549细胞DNMT1 m RNA表达均显著下调(P0.01、P0.001),SPARC m RNA表达均显著上调(P0.001、P0.001);5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用后的A549细胞对顺铂的IC50均显著低于对照组[(12.34±0.36)μmol/L、(10.93±0.69)μmol/L,对照组为(21.54±1.21)μmol/L;P0.01、P0.01];5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1作用后的A549细胞在顺铂环境中,其克隆数显著低于空白对照;15μmol/L顺铂作用24 h时,5 ng/m L、10 ng/m L TGF-β1组细胞凋亡分数均显著高于空白对照(P0.05、P0.01)。结果提示:TGF-β1可下调A549细胞DNMT1的表达,进而上调抑癌基因SPARC并增加其对顺铂的敏感性,成功逆转肺腺癌A549细胞的恶性表型。该研究为进一步阐明肺癌对顺铂的耐受机制提供了新的思路。