化学辅助去核法对绵羊卵母细胞去核率和重构胚发育率的影响

为提高绵羊体细胞核移植的效率,本研究采用一种新的去核方法—化学辅助去核法,对绵羊体外成熟的卵母细胞进行去核,研究了化学诱导剂秋水仙素的处理浓度、作用时间、卵母细胞的成熟时间对去核效果及重构胚发育的影响。结果表明:1)卵母细胞在0.4μg/mL的秋水仙素溶液中分别孵育0.5h和1h,胞质突起率和去核率没有显著的差异,突起率可高达85.4%,去核率达到100%;2)0.2μg/mL或0.4μg/mL秋水仙素溶液将卵母细胞处理0.5h,对去核效果没有显著影响;3)对于体外成熟18～23h的卵母细胞,随着成熟时间的延长,盲吸法的去核率降低,但没有影响秋水仙素诱导胞质突起的比率和去核率;4)两种去核方法对重构胚的发育没有产生显著影响,但成熟21～23h卵母细胞重构胚囊胚的发育率显著高于成熟18～20h卵母细胞重构胚囊胚的发育率。综上所述,本试验优化了绵羊卵母细胞化学辅助的去核程序,利用化学辅助去核法对高卵龄的绵羊卵母细胞进行去核,提高了去核率和重构胚的体外发育率。     

人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达

从人胎盘组织提取总RNA, 采用RT-PCR扩增人溶酶体酸性b-葡萄糖脑苷脂酶(Lysosomal acid b-glucosidase, GlcCerase)基因编码区的全部序列, 并克隆到pMD-19T载体上, 构建克隆载体pMD-GlcCerase。经测序验证后, 将GlcCerase亚克隆至表达载体pEGFP-C1上, 构建了人GlcCerase绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-GlcCerase。采用脂质体法将其瞬时转染至COS7细胞系后, 在细胞中检测到了GlcCerase基因, 并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase生物活性的表达。GlcCerase基因的克隆及其表达, 为进一步了解GlcCerase基因的功能以及利用转基因动物乳腺生物反应器高效生产GlcCerase奠定了基础。     

水稻中cry1Ah1基因密码子优化方案的比较

cry1Ah1基因是本实验室克隆的具有自主知识产权的模式基因,对鳞翅目害虫水稻二化螟等具有高毒力,具有较好的应用前景。为提高cry1Ah1基因在水稻中的表达量,探讨密码子使用频率对基因表达的影响,依据水稻密码子使用频率设计5种不同的优化方案,提高GC含量并去除剪切信号等不稳定因素后合成cry1Ah1基因杀虫活性区域。优化后的基因在大肠杆菌Rosetta(DE3)中正常表达了65 kDa蛋白,表达蛋白对2龄小菜蛾和水稻二化螟初孵幼虫都具有良好的杀虫活性。优化的基因转化水稻日本晴后,PCR阳性率达到87%以上,实时荧光定量RT-PCR和ELISA分析表明全部采用最高频率密码子的优化方案效果最好,Cry1Ah蛋白平均表达量占可溶性蛋白的0.104%。     

转cry1 Ac/cpti基因水稻对土壤氨氧化细菌群落组成和丰度的影响

【背景】氨氧化细菌是驱动硝化作用的关键微生物,其群落多样性变化对土壤氮素转化具有重要意义。转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤微生物群落产生影响。【方法】本研究通过田间定位试验,利用特异引物进行PCR-DGGE（聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳）和荧光定量PCR,分析了种植转cry1 Ac/cpti双价抗虫基因水稻第3、4年土壤中氨氧化细菌群落组成和丰度的变化。【结果】水稻各生育期（分蘖期、齐穗期和成熟期）内,转cry1 Ac/cpti基因杂交稻Ⅱ优科丰8号（GM）的土壤氨氧化细菌16S rRNA基因群落组成、多样性指数与其对应的非转基因杂交稻Ⅱ优明恢86（CK）间均没有显著差异;以DGGE条带为基础的氨氧化细菌群落组成的冗余分析（RDA）显示,GM和CK的土壤氨氧化细菌群落组成只与水稻生育期存在显著相关性（P=0.002和0.018）;同时,水稻各生育期内土壤氨氧化细菌16S rRNA基因丰度在GM和CK间也没有显著差异,但均随水稻生长而变化且在齐穗期达到最高（P〈0.05）。【结论与意义】稻田土壤氨氧化细菌的群落组成与丰度在水稻不同生育期存在差异,但在转cry1 Ac/cpti基因水稻和非转基因水稻间没有显著差异,即一定时期内种植转cry1 Ac/cpti抗虫基因水稻不会影响土壤氨氧化细菌的群落组成和丰度。     

小鼠Lrh-1基因与排卵数间相关性分析

目的 探讨肝受体类似物-1( liver receptor homolog-1,Lrh-1;NR5A2)基因序列差异与小鼠排卵数性状间关系.方法 根据GenBank中NM_001159769序列设计了5对引物扩增Lrh-1基因CDS区,用单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism,SSCP)分析小鼠Lrh-1基因序列差异,分析Lrh-1基因与小鼠排卵数间关系.结果 ①在5对引物中只有引物P2和P5扩增产物存在多态性,引物P2扩增产物存在两种基因型AA和AB型,其中AB型发生(C674A)突变,这种突变导致编码的140位氨基酸由谷氨酰胺变为赖氨酸.②引物P5扩增产物存在三种多态类型SSCP-1、SSCP-2和SSCP-3,SSCP-1和SSCP-3型核酸序列比SSCP-2型少25个碱基,SSCP-3型除缺失区段外,其他区域碱基序列与SSCP-2型有5处碱基突变,而与SSCP-1型核酸序列有34处碱基差异,经BLAST分析,SSCP-2型与NM_001159769序列相似,SSCP-1型与NM_001159769序列相差较多,而与NG_012313.1序列相似,通过氨基酸序列比对分析,SSCP-3型1652处的A→G的突变导致氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸,1678位G→C的突变使原密码子TAC(酪氨酸Y)变为TAG(终止子).③引物P2 AA型(27.27±8.52)与AB型小鼠的平均排卵数(25.92±11.73)间差异无显著性(P＞0.05);引物P5 SSCP-2型平均排卵数(35.00±14.58)显著高于SSCP-3型平均排卵数(19.50±7.94) (P ＜0.05),SSCP-1型(26.2±8.18)与SSCP-2型、SSCP-3型平均排卵数间差异无显著性(P＞0.05).结论 明确了Lrh-1基因序列差异与小鼠排卵数性状间关系,为深入研究Lrh-1基因对动物生殖调控机理提供依据.     

Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck+cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料的选择标记基因

Cre/lox系统通过其Cre重组酶对lox序列进行切割和重新连接,介导lox序列发生特异性重组.利用重组报告基因系统Pactin-lox-hpt-lox-gusA,对Cre/lox系统在水稻(Oryzasativa L.)中介导转基因的剔除进行了研究.Pactin-lox-hpt-lox-gusA系统中选择标记hpt基因侧翼含两个同向lox位点,并位于水稻actinl启动子和gusA基因之间.当hpt在Cre酶作用下被剔除时,actinl启动子可以和gusA基因融合在一起从而驱动GUS表达.通过农杆菌介导获得了分别转cre基因、Pactin-lox-hpt-lox-gusA结构和双价抗虫基因lox-hpt-lox-sck-cryIAc结构的水稻.利用有性杂交方法将cre基因导入到转化lox结构的植株中.在4个转Pactin-lox-hpt-lox-gusA T0植株×转cre T0植株所配组合的30个杂交F1植株中,12个植株表达GUS活性,9个表现潮霉素敏感,表明hpt基因被剔除.研究进一步通过Cre/lox介导剔除转双价抗虫sck cryIAc基因籼稻恢复系明恢86材料基因组中的选择标记hpt基因.在9个转lox-hpt-lox-sck-cryIAcT2代纯合植株×转creT2代纯合植株所配组合的77个杂交F1植株中,56个植株表现潮霉素敏感.分子分析证实在这些对潮霉素敏感的植株中hpt基因已经被剔除.     

三叶虫茶营养成分的分析与评价

通过与老鹰茶虫酿茶和一些品牌绿茶的对比,对三叶虫茶的一般营养成分、茶的生化特征、氨基酸和脂肪酸组成、维生素、矿物质元素进行分析和营养评价,为开发三叶虫茶提供科学依据。方法:用常规方法分析其主要营养素和生化成分;用氨基酸分析仪分析氨基酸组成,并采用WHO推荐的蛋白质模式对蛋白质进行营养评价;维生素和矿物元素含量直接说明其营养功能。三叶虫茶含有36.44%的水浸出物,16.28%的茶多酚、1.39%的氨基酸;氨基酸的种类较为齐全,总含量与传统茶叶相当,9种人体必需氨基酸的总量达到0.722%,是传统茶叶的3~12倍,特别是赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸的含量远远高于常规茶叶,而这4种氨基酸在一般植物食品中都是限制性氨基酸;但其茶氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的含量远远低于常规茶叶,而这3种氨基酸对改善茶汤滋味具有重要作用;三叶虫茶中脂肪酸含量为1.23%,其中多不饱和脂肪酸占35.25%;钙、磷、镁含量较高,铁、铜、锌、锰等的含量丰富;维生素C和维生素E含量与普通茶叶相当。三叶虫茶营养丰富,具备常规茶叶的一些生化特征,可作为茶饮料的代用品;若与普通茶叶混合使用,能在滋味和营养价值上实现互补。     

蝴蝶

鳞翅目昆虫已知约20万种,蝴蝶约占10％,分布范围极广,尤以热带种类最为丰富。它们的个体大小及发育速度相差极大,翅展从最小的约4毫米到最大的约300毫米,生活历期从3周完成一个世代到3年完成一个世代。     

藻红蓝蛋白β亚基体内重组及其色谱分析

藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白,其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接.大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成,但是这方面的报道不是很多.藻红蓝蛋白由两个亚基组成,β亚基(简称β-PEC)含171个氨基酸残基及两个辅基色素藻蓝胆素(简称PCB),分别在Cys-84和Cys-155位以硫醚键共价相连.通过同源性分析获得的由编号为alr0617基因编码的蛋白为藻红蓝蛋白β亚基(β-PEC)中的Cys-84与PCB的连接的催化酶.为了研究层理鞭枝藻藻红蓝蛋白(PEC)β亚基(β-PEC)中藻蓝胆素(PCB)与脱辅基蛋白的连接机制,通过体内重组方式得到色素蛋白PCB-PecB(C155I),分析表明该色素蛋白与β-PEC的吸收光谱和荧光光谱一致.酸性尿素变性实验证明得到的色素蛋白中的藻蓝胆素PCB没有被破坏.使用胃蛋白酶对天然藻红蓝色素蛋白和重组藻红蓝色素蛋白进行相同条件的水解并得到各自的色素肽,高效液相色谱分析表明这两种色素肽相同,由此证明了编号为alr0617基因编码的蛋白质能催化PCB与PecB(C155I)正确共价偶联.     

外周血T淋巴细胞亚群及早期炎症标志物表达对老年非小细胞肺癌化疗预后的影响分析

目的评估外周血T淋巴细胞亚群及早期炎症标志物表达对老年非小细胞肺癌(NSCLC)化疗预后的影响。方法入选2015年1月至2018年12月在武汉科技大学附属孝感医院接受化疗的NSCLC患者86例为NSCLC组,另选本院常规体检的健康人群82名作为对照组,分析两组人群外周血T淋巴细胞亚群与炎症细胞的分布差异。采用Kaplan-Meier单因素生存分析不同临床参数及化疗后不同T细胞亚群和炎症细胞水平患者的生存期,采用Cox比例回归风险模型分析影响NSCLC患者预后的独立影响因素。结果与对照组比较,NSCLC组患者CD3^+(71.31±6.02比68.22±7.09)、CD4^+(40.20±5.79比36.61±7.11)、CD4^+/CD8+(1.49±0.37比1.30±0.56),CD8+(28.43±6.37比31.79±9.88)均降低,而PLT(229.73±58.84比211.32±54.18)、淋巴细胞计数(LY)(1.67±0.61比30.01±8.45)及淋巴细胞百分比(LY﹪)(25.65﹪±6.87﹪比30.01﹪±8.45﹪)均升高,差异具有统计学意义(P均<0.05)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果显示,是否淋巴转移、远处转移及不同TNM分期的患者生存期相比,差异具有统计学意义(P均<0.05);CD8+T细胞≥31.8﹪、CD4/CD8<1.28、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)<3.16及血小板与淋巴细胞比值(PLR)<197的患者生存期较长,差异具有统计学意义(P均<0.05);Cox多因素生存分析结果显示,伴远处转移(HR=9.310)、TNM分期ⅢB-Ⅳ期(HR=1.059)、CD8+T细胞<31.8﹪(HR=2.697)、NLR≥3.16(HR=1.887)及PLR≥197(HR=2.869)是影响老年NSCLC患者预后的独立影响因素(P均<0.05)。结论外周血CD8+T细胞、CD4/CD8比值、NLR及PLR水平是影响老年NSCLC预后的独立影响因素,可作为评估老年NSCLC患者化疗预后的简易生物标志物。