HLA-B2704重链胞外功能区基因片段的克隆表达及其生物学功能的初步鉴定

目的:克隆及可溶性表达 HLA-B*2704重链胞外功能区,并对其生物学功能进行初步鉴定.方法:以HLA-B 位点全长 cDNA 为模板,用 PCR-SSP 方法扩增 HLA-B*2704重链胞外区 cDNA,经测序鉴定后与 pET32a 可溶性核表达载体构建其重组核表达系统,并在大肠杆菌 BL21中表达,采用 Western 印迹及微量淋巴细胞毒阻断实验初步鉴定该蛋白的特异性及其生物学特性.结果:扩增出 HLA-B*2704重链胞外功能区 cDNA 片段,构建的HLA-B*2704 cDNA-pET32a 可溶性核表达载体可在大肠杆菌 BL21表达系统中得到较好表达,表达量约占菌体总蛋白的40%;通过 Western 印迹鉴定了表达蛋白的特异性;通过微量淋巴细胞毒阻断实验发现该重组蛋白具有生物活性并可特异性阻断 HLA-B27阳性细胞的微量淋巴细胞毒反应.结论:在大肠杆菌中表达了具有生物学活性的HLA-B*2704重链胞外功能区,为强直性脊柱炎的机理研究及特异性阻断药物的筛选提供了实验基础和新的靶标.     

甾醇C-22去饱和酶高表达对酵母细胞麦角甾醇合成的影响

通过PCR扩增克隆到酵母菌甾醇C-22去饱和酶基因(ERG5)的编码序列及其终止子序列,以大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEp352为载体,以磷酸甘油酸激酶基因PGK1启动子为上游调控元件构建了酵母菌表达质粒pYPE5。以铜离子螯合蛋白基因CUP1替换ERG5基因内部序列获得ERG5破坏菌株YSE5,其中麦角甾醇的合成被阻断,而积累了甾醇中间体Ergosta-5,7-dien-3β-ol。表达质粒pYPE5转化破坏菌株后使细胞恢复了合成麦角甾醇的能力。说明表达质粒上的ERG5基因得到了功能性的表达。将表达质粒pYPE5转化酿酒酵母单倍体菌株YS58,通过营养缺陷互补筛选到重组菌株YS58(pYPE5)。对重组菌株、破坏菌株和互补菌株细胞甾醇组分和含量进行测定,发现重组菌株和互补菌株的麦角甾醇和总甾醇含量明显低于对照菌YS58(YEp352)。测定不同培养时间细胞的麦角甾醇含量,发现重组菌株的麦角甾醇含量始终低于对照菌YS58(YEp352)。可见,ERG5在酵母中的高表达导致细胞麦角甾醇含量降低。     

盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因（ThGPX6）的克隆及表达分析

谷胱甘肽过氧化物酶在植物响应盐胁迫中具有重要作用。依据盐芥EST序列进行RACE实验,获得1个新的谷胱甘肽过氧化物酶基因,命名为ThGPX6(GenBank注册号为FJ357244)。该基因的cDNA全长892 bp,包含1个长为702bp的开放读码框,编码234个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白具有植物GPX的典型结构,即GPX催化活性区(NVASKCGLT)和标志性基序(ILAFPCNQF),以及PHGPX特有序列(KWNF(S/T)KFL)。实时荧光定量PCR分析结果表明,ThGPX6在盐芥叶片和根中表达,其表达受NaCl诱导,显示ThGPX6在植物高盐响应中发挥作用。亚细胞定位结果表明,ThGPX6存在于线粒体和内体中的可能性最大,预示着ThGPX6在清除ROS过程中起着重要作用。     

AGEs通过SDF-1/CXCR4轴信号通路对心肌微血管内皮细胞血管新生的影响及机制

目的:探讨AGEs通过刺激SDF-1/CXCR4轴信号系统对心肌微血管内皮细胞的增值、迁移、管样结果形成的影响以及AMD3100对其的干预作用.方法:用不同浓度的AMD3100作用于浓度为200mg/L的AGEs共孵育的CMECs24h,用MTT法检测细胞活力及增殖能力,并选择合适的干扰浓度(抑制效果居中).随机选取加入AGEs200ml/L的CMECs,加入合适浓度的AMD3100,分别作用24、48、72h,采用MTT法测定AGEs处理前后细胞增值率的变化,并检测AMD3100对增值率的影响;毛细血管管腔样结构形成实验检测对CMECs血管新生的影响和AMD3100对其阻断作用的影响.结果:心肌微血管内皮细胞增殖能力和迁移能力在24h、48h、72h有显著增强;并促进了心肌微血管内皮细胞管样形成(vs P＜0.05);CXCR4受体阻断剂AMD3100作用于细胞后,可以显著阻断AGEs对心肌微血管内皮细胞增殖能力和迁移能力和管腔形成(vs P＜0.05)的影响.结论:AGEs在早期显著增强了心肌微血管内皮细胞的增殖、迁移和管样结构形成的能力,其作用机制可能与SDF-1/CXCR4轴信号通路有关.     

低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞迁移和NO分泌能力的影响

目的:研究在固定时间和频率下,矩形波形低频脉冲磁场(LF-PMF)对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)迁移和NO分泌能力的影响。方法:实验分为4组(对照组,1.0MT组,1.4MT组,1.8MT组)。对照组不加磁场干预,其余各组分别在频率为15Hz,磁场强度分别为1.0MT、1.4MT和1.8MT,时间为4h/d,连续照射3d的条件下,用三角波形作用离体培养的大鼠CMECs。利用transwell检测细胞迁移能力,硝酸还原酶法检测CMECs培养液中NO含量的变化。结果:1.0MT组,1.4MT组和1.8MT组LF-PMF迁移能力与对照组相比均有不同程度提高[(24.40±5.12)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.05;(31.40±3.81)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.05;(37.40±4.01)(个/视野)vs(22.00±3.87)(个/视野),P<0.01]。1.0MT组,1.4MT组和1.8MT组LF-PMF的NO分泌能力与对照组相比均有提高[(25.26±1.06)(μmol/L)vs(19.18±2.88)(μmol/L),P<0...     

艳婀珍蝶取食对薇甘菊叶片生理指标的影响

艳婀珍蝶取食后,对薇甘菊叶片的超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性,总酚含量,有机自由基(DPPH·)清除能力进行分析。结果表明,取食后3h内所测各量即发生变化,但与对照差异不显著。取食4d中,叶片的SOD、POD活性总体上分别高于对照,CAT活性总体上低于对照,说明在艳婀珍蝶胁迫过程中,SOD和POD所起的作用比CAT大。取食叶SOD、POD活性均在48h时达到最大值,之后下降;CAT活性在24h时达到最大值,之后也迅速下降。取食叶PPO活性动态变化程度较大,表现出3个峰值,分别为对照的1·83,1·92倍和2·17倍;总酚含量表现为先上升后下降的趋势;对DPPH·的清除力一直显著性甚至极显著性低于对照。取食叶的SOD与CAT和POD均呈正相关性,且相关性大于对照;PPO与总酚含量在取食叶与对照中也均呈弱正相关性。实验结果表明,薇甘菊的保护酶对艳婀珍蝶胁迫的应激效应是短暂而有限的,艳婀珍蝶的取食破坏了薇甘菊叶片功能,较大程度的干扰了薇甘菊保护酶系统的防御代谢,薇甘菊的总抗氧化能力降低。薇甘菊也不能通过改变酚类物质含量来抵御艳婀珍蝶的取食,艳婀珍蝶取食对薇甘菊有较明显的控制作用。     

鸡Ⅱ型胶原基因疫苗pcDNA-CCOL2A1能有效治疗大鼠类风湿性关节炎

已证明Ⅱ型胶原(CII)是类风湿性关节炎(RA)最主要的自身免疫抗原, 采用口服鸡Ⅱ型胶原蛋白(CCII)诱导免疫耐受治疗RA标志着RA治疗策略的重大进展之一. 在国际上克隆成功鸡Ⅱ型胶原蛋白基因(CCOL2A1)的基础上, 探讨了采用pcDNA-CCOL2A1基因疫苗策略治疗RA的科学性和可行性. 将克隆的CCOL2A1基因连接于真核表达载体pcDNA3.1(＋)上, 即为基因疫苗pcDNA-CCOL2A1. 然后将该表达载体pcDNA-CCOL2A1 转染COS-7细胞, 经Western blot分析显示, pcDNA-CCOL2A1在COS-7细胞中是以分泌型来表达CCII多肽链的α亚单位. 随后, 以CCII诱导的 Wistar大鼠为RA模型即CIA, 系统观察一次性尾部静脉注射20, 200, 400 μg/kg 3个不同剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗对CIA关节炎的治疗作用. 结果表明, 在注射后第5天200 μg/kg组就可观察到大鼠关节肿胀程度明显减轻, 与空载体组比较有显著性差异(P <0.05), 而20, 400 μg/kg两剂量组与空载体组比较未观察到治疗效果(P>0.05). 注射后6周, CIA大鼠血清中抗CII抗体浓度水平、TNF-α浓度在200 μg/kg治疗组较空载体组明显降低(P<0.05), 而400 μg/kg组则显著的升高, 20 μg/kg组则无明显变化. 此外, 细胞因子TGF-β, IL-10浓度水平在200 μg/kg组较空载体组明显升高(P<0.05), 而20与400 μg/kg两组则无显著性差异. 脾细胞淋巴细胞增殖实验表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗治疗组大鼠脾细胞对CII的反应能力较空载体组明显下降(P<0.05). 此结果表明, 200 μg/kg剂量pcDNA-CCOL2A1基因疫苗能明显抑制CIA大鼠关节肿胀程度, 降低抗CII抗体、TNF-α水平, 提高细胞因子TGF-β, IL-10水平, 降低脾细胞增殖反应能力, 对CIA大鼠关节炎有显著的治疗作用.     

海刀豆的抗逆生理生化特征分析

为了解西沙群岛上海刀豆(Canavalia maritima)的抗逆特性,对其叶片解剖结构、生理学特征和养分状况进行了分析。结果表明,海刀豆叶片的栅栏组织发达,气孔密度大;叶绿素a/b低于3∶1;抗氧化酶活性普遍较高,以SOD活性最大;脯氨酸含量高;在土壤养分含量较低的情况下,叶片中的营养元素含量仍然较高。因此,海刀豆具有耐干旱、强光、高温和贫瘠等抗逆生物学特性,可以作为热带珊瑚岛(礁)防风固沙和植被恢复物种。     

用伊文思蓝染色法检测植物整体叶片的细胞活性

本文利用伊丈思蓝（evans blue）作为细胞活性染料,检测了胁迫处理后3种草本和2种灌木植物叶片的细胞活性。结果显示,不同类型的胁迫（温度、PEG、Pb、Cd、NaCl和NaHSO3）均造成了叶片细胞一定程度的伤害。随着各种胁迫的加剧,叶片染色面积和染色后提取液吸光度都呈现梯度增加的趋势。研究分别利用染色面积和其提取液吸光度表达叶片细胞的活性,提出了一种更安全、更准确的植物整体叶片细胞活性检测方法。     

WDR91-WDR81复合体调控内吞体-溶酶体运输及神经发育

WD40重复序列蛋白在真核生物中广泛存在,并参与胞内运输、信号转导、凋亡发生、转录调控等生命过程.通过以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模式动物进行遗传筛选,本课题组发现了两个新基因,其人类同源基因编码WD40重复序列蛋白WDR91和WDR81,然而此前对这两种蛋白的功能知之甚少.本课题组后续工作发现, WDR91和WDR81形成复合体,作为晚期内吞体的特征性小GTP酶Rab7的效应因子被招募到内吞体上,与Ⅲ型磷酯酰肌醇-3-激酶(PI3K)复合体的Beclin 1亚基相互作用,抑制内吞体上磷脂酰肌醇3-磷酸(PtdIns3P)的合成,使早期内吞体向晚期内吞体转化,从而确保内吞体-溶酶体运输得以实现. WDR91-WDR81复合体与神经发育紧密相关,具体表现在特异性敲除WDR91的小鼠神经突起生长受损,而WDR81通过内吞体SARA-TGFβ信号通路影响成体神经发生.此外, WDR81还可作为衔接蛋白结合p62和LC3C,以不依赖于WDR91-WDR81复合体的形式促进蛋白聚集体的选择性自噬.这些发现为揭示WDR91和WDR81相关的神经系统疾病致病机制提供了重要理论依据.