麦迪霉素生物合成基因克隆研究

利用穿梭粘粒载体pNJ1组建了麦迪霉素产生菌Streptomyces mycarolaciens 1748的基因文库,用与麦迪霉素生物台成有类似途径的放线紫红素聚酮合成酶基因Act I,Act Ⅱ为探针,从麦迪霉素产生菌的基因文库中,获得了与ActI,Act Ⅱ基因有同源性的阳性克隆,对其中PCNSBl2、6C5及11E11克隆DNA进行了酶切分析,其分子量分别为36kb,48．5kb及41．6kb。PCN6C5 DNA中包含有PCN 8B32的全部DNA片段,PCN ⅡEⅡ与PCN 8B12及PCN 6C5有6．75kb的重叠区。通过分子杂交实验,初步将麦迪霉素聚酮台成酶基因定位在PCN 8812 DNA的EcoR I—BamH I 4．02kb片段上(与Act Ⅱ基因有同源性)及PCN 8B12(6C5),PCNIIEIIDNA BgⅡ—BgⅡ 2．42kb与PCNllE11 Bgl I—B g1 I 1Okb片段上(与Act I基因有同源性)。PCN 8B12及PCN 6C5克隆DNA在麦迪霉素聚酮合成酶基因缺陷型变株Streptomyces mycarofaciens var．68及不产抗生索的变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24受体菌的表达产物,经TLC及HPLC等分析表明与麦迪霉素标准品相似。     

格尔德霉素生物合成基因功能的验证

格尔德霉素(Geldanamycin, Gdm)作为热休克蛋白90的特异性抑制剂, 是非常有前景的抗肿瘤和抗病毒的药物,我们已从吸水链霉菌17997(Streptomyces hygroscopicus 17997)的基因文库中获得了Gdm大部分生物合成基因。为了研究主要基因的功能, 选择了聚酮合酶基因(Polyketide synthase gene, pks)的第六模块、单加氧酶基因(Mono-oxygenase gene, gdmM)和氨甲酰基转移酶基因(Carbamoyltransferase gene, gdmN)3个基因作为靶点分别进行基因阻断, 获得了基因同源双交换的阻断变株△pks、△gdmM和△gdmN。经HPLC检测证实这些基因的阻断变株均不产生Gdm, 基因回复实验排除了基因阻断所可能造成的极性效应对其它基因表达的影响, 说明所克隆的pks、gdmM和gdmN基因确实是Gdm生物合成所必须的基因。