耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分型及流行现状

【目的】研究杭州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的基因型别,探讨MRSA菌株流行变化趋势及进化特点,为该地区MRSA的进一步防治提供科学依据。【方法】对86株MRSA进行葡萄球菌盒式染色体SCCmec基因、spa基因分型,并开展多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST),与国际上MRSA的流行型别进行比较,分析进化关系。【结果】86株MRSA共发现13个spa型(以t311型为主,占48.8%;其次为t6418型,占11.6%);MLST分型共发现9个ST型(以ST5为主,占59.3%;其次为ST239,占16.3%),经e BURST软件分析它们属于4个群(Group 1、Group 6、Group 8、Group 12)和8种克隆复合体(CC1、CC5、CC630、CC20、CC59、CC88、CC239、CC573);SCCmec基因分型以SCCmecⅡ型为主,占61.6%;其次为SCCmec III型,占22%;5株社区相关性MRSA(SCCmec-Ⅳ型)。其中第一流行克隆型为SCCmec-Ⅱ-ST5-t311-CC5(占47.7%)、其次为SCCmec-III-ST239-t030/t037-CC239(占12.8%)。【结论】SCCmec-Ⅱ-ST5-t311为杭州地区当前流行菌株;CA-MRSA菌株的出现,提示MRSA菌株有由医院向社区播散的趋势;此外,对新发展了单位点变体的菌株(SCCmec-Ⅰ-ST1921-t164-CC20和SCCmec-Ⅳ-ST965-t062-CC5),应加强重视。     

倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

慈姑45S rDNA和端粒序列检测及核型分析

以45S r DNA和拟南芥型端粒序列为探针对慈姑(Sagittaria trifolia L.)有丝分裂中期染色体进行单色和双色荧光原位杂交分析,并用银染方法检测慈姑45S r DNA位点的表达,最后结合染色体测量数据和45S r DNA杂交信号建立慈姑的核型。结果显示,慈姑的单倍基因组总长度为76.9±1.38μm,最长染色体为11.55±0.10μm,最短染色体为4.54±0.27μm;慈姑的核型公式为:2n=22=2m+2sm+14st+4t,核型不对称性参数CI、A1、A2、As K(%)、AI分别为19.86±11.06、0.72、0.27、78.82、15.29,核型属于Stebbins类型中的3B型。慈姑具有3对45S r DNA位点,分别位于第8、9、10号染色体的短臂末端。拟南芥型端粒序列的杂交信号出现在慈姑每一条染色体的长、短臂末端。银染检测到6个Ag-NOR和6个核仁,表明3对45S r DNA位点在间期核都有表达。本研究结果为药食兼用植物慈姑提供了分子细胞遗传学基础资料。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。     

当前人类基因研究存在缺陷

澳大利亚研究人员完成的一项研究显示，无脊椎动物——一种珊瑚虫具有许多同脊椎动物人类相同的基因。让研究人员更加感到意外的是，在苍蝇和蠕虫这类动物身上并没有找到某些珊瑚虫和人类相同的基因。新的发现导致人们对利用苍蝇和蠕虫作为模式生物揭示人类基因的某些研究提出了疑问。     

藤稔葡萄花发育相关基因启动子的克隆及功能分析

采用基于热不对称交错式PCR的基因组步移法,从藤稔葡萄(Vitis vinifera×V.labrusca‘Fujiminori’)的基因组总DNA中扩增花发育相关基因FT、FLC、AP3和AG的启动子上游序列片段,并通过序列分析及PlantCARE在线预测对FT、FLC和AP3启动子片段的序列及顺式调控作用元件和功能进行了分析.扩增结果表明:AG的第1轮扩增产物无明显条带,第2轮扩增产物条带弥散,不能用于序列分析及顺式调控作用元件和功能分析;FT、FLC和AP3基因2轮扩增产物均有特异条带,FT、FLC和AP3启动子序列的实际长度分别为1 470、1 698和1 061 bp,GenBank登录号分别为HM192806、HM192805和HM192804.PlantCARE在线预测结果表明:FT、FLC和AP3启动子片段中均含有TATA-box、CAAT-box等启动子的特异表达元件及光响应元件、真菌刺激响应元件、MYB结合位点等多个顺式调控作用元件,共同受真菌刺激、MYB和光等因素的调控;FT、FLC和AP3均可能在花的分生组织中表达,且FT和AP3还可能在胚乳中表达.根据研究结果推测:FT、FLC和AP3基因的启动子序列片段中均存在多种诱导响应元件,可能均为诱导型启动子.     

大肠杆菌中表达关键基因产异丁醇的研究

目的:改造大肠杆菌的代谢途径,使非生产菌株大肠杆菌具备产异丁醇的能力.方法:将乳脂乳球菌NIZO B1157的2-酮酸脱羧酶基因kdcA克隆到大肠杆菌中,使大肠杆菌产异丁醇;另外,采取两种方法过量表达alsS、ilvC、ilvD基因,增加前体物质酮酸的供应,以提高异丁醇的产量:一是与kdcA串联表达;二是在另一个相容质粒中表达.结果:大肠杆菌工程菌具备产异丁醇的能力,其中相关基因在一个质粒中串联表达的产量比其在两个相容质粒中共表达的产量高30倍,达到3g/L.结论:导入的酮酸合成途径与醇类生产途径结合,能使非生产菌株大肠杆菌生产异丁醇,并且单质粒表达代谢途径相关基因的效果优于双质粒表达.     

悬钩子属植物肌动蛋白基因片段的克隆与表达

目的:克隆悬钩子属植物肌动蛋白基因(actin),为研究该物种中其他基因的表达和调控提供内标基因.方法:利用一对特异性引物从黑莓、悬钩子杂种和树莓品种中克隆actin cDNA片段,对其进行序列分析和半定量RT-PCR表达分析.结果:从3个品种中均获得一条783 bp actin cDNA片段,编码260个氨基酸,3条actin片段与其他植物核苷酸序列的同源性都在82%以上,与其他植物氨基酸序列同源性也均在95%以上;树莓和悬钩子杂种品种的actin核苷酸和氨基酸序列同源性均达99%,系统进化分析也发现两者亲缘关系较近些;表达分析发现actin基因在各品种不同组织中均有一定的表达量.结论:首次克隆了悬钩子属植物肌动蛋白基因actin,将来自黑莓和树莓品种的序列登录在GenBank,登录号分别为HQ439556和HQ439557.     

柞蚕热休克蛋白70基因的克隆和序列分析

HSP70蛋白是受热等因素刺激后而诱导产生的蛋白质,是热休克蛋白家族中最重要的一员。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)热休克蛋白70基因(HSP70)的ORF序列(GenBank登录号:GU945199),该片段的序列长度为1905bp。生物信息学分析表明,该序列共编码634个氨基酸,预测蛋白的等电点和分子量大小分别为5.62kD和69.5kD。具有HSP70的保守性结构特征,与天蚕(Antheraea yamamai)、家蚕(Bombyx mor)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、棉铃虫(Heliothis viriplaca)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、烟草夜蛾(Manduca sexta1)、膜翅目寄生蜂(Cotesia rubecula)的同源性分别为95.7%、78.5%、76.1%、77.3%、76.6%、74.7%、65.9%。根据它们的一级结构构建了系统进化树,进一步确立了它们之间的亲缘关系。     

甘蓝型油菜BnCOP1基因编码区全长cDNA的克隆与功能研究

通过分析拟南芥、豌豆、番茄和水稻的COP1 (constitutively photomorphogenic 1) 的cDNA序列, 运用RT-PCR和改进的基因组步行 (genome walking) 技术相结合的方法, 首次从甘蓝型油菜中克隆到油菜 BnCOP1编码区cDNA的全长序列, 其全长2 034 bp, 编码677个氨基酸. 同源 性分析表明, 其编码的氨基酸序列与拟南芥的同源性高达94%. 对BnCOP1编 码序列（cDNA）演绎出的氨基酸序列分析表明, 其编码的蛋白包含有N端的 环形锌指结合域(ring finger zinc binding domain, RING)、中间的卷曲 螺旋形结构域(coiled-coil domain, coiled-coil ), 7个C端的WD-40重复 序列(WD-40 repeats, WD-40)的功能域. 半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR 分析该基因在油菜中的表达模式,结果显示, BnCOP1在甘蓝型油菜的各个组 织器官中均有表达,其中在花中的表达明显高于在根、叶、茎、果荚及子叶 和胚轴中,暗示该蛋白可能与开花途径相关. 过表达BnCOP1的转基因拟南芥 植株在高度、主茎的直径和叶片大小上都呈现出比野生型弱小的表型, 表 明BnCOP1抑制了拟南芥光形态建成从而影响了植物的生长发育.