人内皮抑素抗肿瘤相关肽基因的克隆表达及活性研究

目的 克隆并表达人内皮抑素抗肿瘤相关肽,检测其生物活性。方法 人工合成人内皮抑素1—30位氨基酸（30肽,序列25—31由RGIRGAD改为RGDRGD）所对应的核苷酸序列,连接到质粒pTYB2中,再转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中表达,几丁质亲和层析树脂一步纯化30肽。通过MTT法、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）实验、小鼠体内抑瘤实验比较30肽和内皮抑素抗肿瘤活性。结果 MTT证实30肽体外对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、胃癌7901细胞（SGC-7901）半数抑制浓度IC50为36μg／ml、47μg／nl,显著低于内皮抑素IC50179μg／ml、202μg／ml。CAM实验中30肽对血管的抑制作用更强。30肽在小鼠体内抑瘤率47．8％,效果优于内皮抑素28．7％。结论 30肽具有更强抗肿瘤活性,有可能成为治疗肿瘤的一种新药物。     

鲤微卫星引物对麦穗鱼的适用性初步研究

麦穗鱼（Pseudorasbora　parva　Temminck　et　Schlegel）是淡水中广泛分布的小型鱼类,属鲤科（Cyprinidae）、鲍亚科（Gobioninae）、麦穗鱼属（Pseudorasbora　Bleeker）。常见于中国东部地区各大水系,朝鲜、日本也有分布。开展小型鱼类种群遗传多样性研究,能为合理开发利用小型鱼类资源,发展鱼食性鱼类增养殖,优化湖泊渔业结构提供重要的基础资料。     

皮瓣移植结合骨牵张技术修复感染性胫骨复合皮肤组织缺损的临床效果观察

目的：观察皮瓣移植结合骨牵张技术修复感染性胫骨复合皮肤组织缺损的临床效果。方法：自2008年6月至2012年6月,共收治了胫骨感染性复合组织缺损16例,采用一期彻底去除病变坏死组织和病变的胫骨断端,切取同侧腓肠肌皮瓣、腓肠神经营养血管皮瓣转位、对侧小腿内侧皮瓣和游离皮瓣移植修复小腿皮肤缺损,二期行骨牵张延长术进行治疗。结果：所有16例胫骨复合组织缺损病例感染均得到了控制,移植的皮瓣顺利成活,胫骨截骨延长区成骨良好,断端骨愈合,其中2例出现针道感染,无血管神经并发症发生。骨延长2～9cm,平均延长5．5cm。外同定延长支架在停止骨延长8-20个月后拆除,双下肢等长,膝关节和踝关节功能良好。术后细菌培养＋药敏结果：金黄色葡萄球菌感染8例,表皮葡萄球菌感染4例,大肠杆菌感染1例,阴沟肠杆菌感染l例,肠球菌感染l例。结论：伤口彻底清创,胫骨断端坏死骨切除后一期行皮瓣移植,二期行骨牵张延长术是一种治疗感染性胫骨复合组织缺损的有效方法。     

拟穴青蟹线粒体COI基因序列克隆及SNPs位点分析

根据拟穴青蟹(Scylla paramamosain)线粒体全序列设计引物,采用PCR产物双向测序法,克隆了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因部分序列(761 bp),并筛选、分析了拟穴青蟹的SNPs位点.共分析了采自福建省宁德市的16只拟穴青蟹,另外,从GenBank数据库中下载了31条前人提交的拟穴青蟹COI基因序列(长度在425-522 bp之间).利用MEGA 4.0软件对所有序列进行比对分析,结果表明碱基T、C、A和G的平均含量分别为37.6％、17.8％、28.9％和15.7％,G+C的含量平均为33.5％.分析结果表明,在所克隆的761bp的COI基因序列中共发现29个SNPs位点,其出现频率为3.8％.在这29个SNPs位点中,13个为C/T转换(占44.8％),12个为A/G转换(占41.4％),2个为A/T颠换(占6.90％),1个为G/C颠换(占3.45％),另有一个位点(201 bp处)发生了A/C颠换和C/T转换两种类型的碱基替换.氨基酸分析表明,在29个SNPs位点中,有9个位点属于非同义突变,引起了氨基酸的变化;其他20个位点属于同义突变,未引起氨基酸的变化.这将为拟穴青蟹遗传背景和群体遗传多样性研究提供新的分子标记.     

悬游双眉虫(原生动物,纤毛门)无性生殖期间的形态发生

应用蛋白银染色技术研究了悬游双眉虫青岛种群无性生殖期间皮层结构和核器的演化过程,其主要特征为:后仔虫口原基独立地出现于紧靠虫体左侧第一根横棘毛的皮层下小龛,其中毛基粒不参与其它棘毛原基的形成;老的口围带发生后半部的局部重建而非整个的由前仔虫简单继承;在前仔虫中,波动膜原基来自老结构的反分化,而在后仔虫中则来自口原基;所有棘毛原基均为独立发生并与老结构没有任何关系;在前仔虫中,口棘毛(即左侧第一根额棘毛)来自于波动膜的反分化,而在后仔虫中则为独立发生;背触毛列于老的结构当中产生,并由最右一列原基演化出3根尾棘毛;两大核片段的改组带从一端向另一端移动 ,并随着两者的融合而消失.文中同时对前人有关该属发生模式的若干存疑问题做了探讨 [动物学报 54(3):517-524,2008].     

利用核糖体DNA限制性酶切谱(ARDRA)分子技术和小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列分析对五种双眉虫(原生动物,纤毛门,游仆目)种内及种间关系的探讨

从12种限制性内切酶中筛选出6种可获得种间多样性的内切酶:Alu Ⅰ,Taq Ⅰ,Hae Ⅲ,Hinf Ⅰ,Msp Ⅰ,Xba Ⅰ,对广义双眉虫Diophrys-complex5个种(伪寡毛双眉虫Diophrys apoligothrix、悬游双眉虫D.appendiculata、盾圆双眉虫D.scutum、秀丽拟双眉虫Paradiophrys irmgard、针毛类双眉虫Diophryopsis hystrix)共7个种群的核糖体基因(18S小亚基、部分23S大亚基及其内转录间隔区域)进行多位点酶切。结果显示,种间差异明显大于种内差异。利用RAPDistance1.04软件构建的邻接树表明,盾圆双眉虫的3个种群表现出高度的同源性;3个近缘属(双眉虫属、拟双眉虫属、类双眉虫属)可以被明确区分,并支持类双眉虫属与拟双眉虫属的独立性。从GenBank/EMBL数据库中获得广义双眉虫及相近种的小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列,利用邻接法(NJ),贝叶斯法(Bayesian)和最大简约法(MP)构建的系统发生树具有基本一致的拓扑结构,结果显示:狭义双眉虫属Diophrys为单源发生系,并与类双眉虫属Diophryopsis组成姐妹群;尽管拟双眉虫属Paradiophrys具有广义双眉虫典型的形态学特征,但与尾刺虫属Uronychia有着较近的亲缘关系。本工作同时表明,核糖体DNA限制性酶切(ARDRA)技术可靠地区分纤毛虫的形态相似种,并在双眉虫属间水平的系统关系推定中存在一定的适用性。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究

目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

青岛沿海七种腹毛类纤毛虫的形态学研究(原生动物,纤毛门)

借助活体观察及银染法等对采自青岛沿海的7种较罕见的腹毛类纤毛虫(拉氏游仆虫Euplotes raikovi,拟伍氏游仆虫Euplotes parawoodruffi,坚盾檐纤虫Aspidisca leptaspis,斯坦槽纤虫Aspidsca steird,收缩沙冠虫Psammnomitra retractilis,柔弱异列虫 Anteholosticha manca,条纹小双虫Amphisiella annulata)进行了形态学研究,包括两个国内新纪录:拉氏游仆虫,拟伍氏游仆虫,同时补充了各青岛种群的纤毛图式及银线系等资料.对迄今缺乏详细研究的拉氏游仆虫首次做了纤毛图式水平上的描述并在前人工作基础上给出了修订后的定义:活体约40～60 μn×25～40 μn,背部有明显的6列嵴突;口区延至虫体1/2后;口围带由23～35片小膜组成;额-腹棘毛包括7根典型棘毛以及位于额区中部的仅由1对毛基粒构成的退化结构;稳定的1根缘棘毛、2根尾棘毛;背触毛6～8列;银线系为double-patella型;海水种.     

半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF783的克隆及其在遗传性别鉴定中的应用

半滑舌鳎性别控制和全雌育种等研究领域中迫切需要一种能够快速鉴定鱼类个体遗传性别的有效方法。文章采用AFLP技术, 利用选择性引物组合(E-ACT/M-CAA)从半滑舌鳎中筛选到一条雌性特异的AFLP标记。对该标记进行二次PCR扩增、琼脂糖凝胶回收、克隆、测序。分析表明, 序列全长为791 bp, 与GenBank中的序列无同源性。以该雌性特异AFLP标记DNA序列为模板, 设计了一对特异的PCR引物, 成功地将其转化为SCAR(Sequence characterized amplified regions)标记, 并在100尾已知性别的半滑舌鳎个体(雌雄各50尾)中进行验证, 结果表明, 该SCAR标记在所有雌性个体中均扩增得到一条长度为324 bp的DNA条带, 而在49尾雄性个体中均扩增不到该DNA条带(有1尾雄性个体例外), 证明该SCAR标记是雌性特异的, 并可用于半滑舌鳎个体遗传性别鉴定。随后, 利用该SCAR标记检测了3日龄半滑舌鳎幼苗, 结果表明, 雌性个体比例为41.7%。     

一种从鱼类肌肉组织中提取基因组DNA的简易方法

以泰山螭霖鱼、黄河鲤鱼、东平湖鲫鱼为材料,采用改进的酚-氯仿抽提法和蛋白酶K消化法提取基因组DNA,并对其进行紫外分光光度、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、微卫星PCR扩增等方法的鉴定。结果表明,本方法提取的鱼类基因组DNA浓度为0．9-3．25μg／μL,D260nm/D280nm值为1．79-1．87,电泳条带整齐明亮,适合微卫星PCR扩增。因此,本方法能够从鱼类肌肉组织中获得较为纯净的基因组DNA,适于进一步的分子生物学研究之用。