利用EST序列构建Mascot本地数据库

对蛋白质质谱数据进行数据库比对和鉴定是蛋白质组学研究技术中的一个重要步骤。由于公共数据库蛋白质数据信息不全,有些蛋白质质谱数据无法得到有效的鉴定。而利用相关物种的EST序列构建专门的质谱数据库则可以增加鉴定未知蛋白的几率。本文介绍了利用EST序列构建Mascot本地数据库的具体方法和步骤,扩展了Mascot检索引擎对蛋白质质谱数据的鉴定范围,从数据库层面提高了对未知蛋白的鉴别几率,为蛋白质组学研究提供了一种较为实用的生物信息学分析技术。     

利用Red系统快速敲除家蚕核型多角体病毒orf60基因

用Red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒（BmNPV）bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPV orf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPV bacmid,将其电转化到含有质粒pKD46（能表达Red重组酶）的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物（5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因（cat）的首尾序列）,以pKD3质粒（含cat）为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPV bacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPV orf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。     

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的纯化、诱导细胞凋亡和抗菌作用

经过分子筛层析和离子交换层析,我们从竹叶青(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中纯化得到了竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(TSV-LAO)。实验表明,TSV-LAO是一种糖蛋白,其分子由非共价连接的两个相同的亚基组成,SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳一个亚基的表观分子量为58 kDa。TSV-LAO酶比活力为1100 U/mg,其分子脱掉糖基化成分后不影响酶活力。TSV-LAO在浓度为1.0μg/mL以上时可以诱导C8166细胞凋亡。TSV-LAO对实验病原微生物具有选择性抗生作用并具有明显的量效关系,对白色念珠菌(ATCC2002)、金黄色葡萄球菌(ATCC2592)和短小芽孢杆菌(CMCCB11207)的最小抑菌浓度分别是0.3,0.4和1.0μg/mL,即使在最高实验浓度10μg/mL,TSV-LAO对其它实验菌株也未显示抑菌作用。     

家蚕二分浓核病毒在家蚕细胞中的体外拯救

家蚕二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus,Bm BDV)是特异性感染家蚕中肠引起慢性浓核病症的致病原,基因组含有2套单链DNA分子(VD1和VD2),复制机制尚不清楚。为了能够在体外拯救出有感染性的病毒粒子,构建了Bm BDV的基因组全长的克隆质粒p MD18T-VD1和p UC-VD2,并通过酶切构建的克隆质粒来获得双链的基因组片段VD1和VD2,利用脂质体包埋的方法,线性化共转染Bm N细胞。提取转染后的Bm N细胞总DNA,经去甲基化处理后,通过PCR检测到病毒基因的复制;提取转染后的Bm N细胞和添食回感的家蚕中肠的总蛋白,分别进行蛋白质印记杂交检测,检测到病毒基因的表达。由此首次表明,该病毒线性化的基因组片段通过共转染Bm N细胞的方法,可以在体外条件下拯救出具有感染性的病毒粒子。     

多囊体生物发生和蛋白质分拣——ESCRT、Vps4、Ubiquitination一个都不能少

多囊体(multivesicular body,MVB)是由晚期内吞体的限制膜内陷出芽而形成的动态的亚细胞结构,是真核细胞重要的膜和蛋白质运输与分拣中心,并与信号转导、胞质分裂、基因沉默、自噬、蛋白质的质量控制、病毒出芽等密切相关.多囊体生物发生涉及20多种囊泡分拣蛋白(Vps),最重要的是在内吞体膜上形成的4种内吞体运输分拣复合物(ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)和Vps4.ESCRT 0与包涵素在内吞体膜上形成微域并富集泛素化的货物蛋白.ESCRTⅠ和Ⅱ诱导MVB囊泡出芽、促进囊泡形成并分拣货物蛋白到囊泡中.ESCRTⅢ收缩及剪切芽颈,完成最后的膜脱落过程.Vps4解离ESCRT以循环利用.泛素化及泛素化蛋白也能修饰或调控ESCRT的定位及功能.这些研究表明,泛素化蛋白、ESCRT和Vps4在内吞体膜上的相继协同作用是驱动紧密偶联的多囊体生物发生及蛋白质分拣的主要力量.本文以蛋白质-蛋白质相互作用为主,综述了ESCRT复合物及Vps4多聚体的组装机制、相互作用、生理功能以及泛素化蛋白和泛素化对ESCRT的调控,并对下一步研究进行了展望.     

基于Make2D-DB II构建水稻二维电泳-质谱联动数据库

基于Make2D—DBII软件包构建了一个水稻二维电泳-质谱联动数据库Rice2DDB,介绍了该数据库的构建方法和步骤,为快速发展的水稻蛋白质组学研究提供了数据管理和交流的平台,对其他物种的蛋白质组学研究也具有参考价值。     

一种新的家蚕信息素相关蛋白基因BmP218的生物信息学分析及功能预测

在进行抑制性减法杂交实验中,我们获得一条差异基因片段,EST拼接终获得了这一个654bp ORF阅读框,NCBI数据库检索未发现同源基因.但在家蚕数据库检索有同源基因存在为一种信息素相关的结合蛋白,PCR实验结果表明该基因确实在家蚕多种组织中存在转录,证明是一种新的基因,暂命名为BmP218.进一步生物信息学分析表明该定位在家蚕的第23号染色体上,有7个外显子.其同源物物有8个,虽然基因结构不同,但结构域非常相似.蛋白质分析中发现蛋白结构中包含有6个α螺旋,12个不规则卷曲,在氨基酸序列中存在有一段与昆虫细小病毒表壳蛋白类似的区域(100-183).     

基于动态权重匹配的RNA折叠算法

本文在最大权重匹配（Maximum Weighted Matching,MWM）算法的基顾础上引入与茎区长度相关的动态权重,采用一种递归算法逐步寻找具有最大权重和的茎区。从而最终确定RNA的二级结构．该算法避开了繁杂的自由能计算,同样也能达到较高的预测精确度并且还能预测到大多数类型的潜在假结（pseudoknots）．     

动物bHLH转录因子家族成员及其功能

bHLH转录因子在真核生物生长发育调控过程中具有重要作用。动物bHLH转录因子包含45个家族, 分别参与调控神经元发生、肌细胞生成、肠组织发育以及环境毒素响应等生物学过程。过去20年里, 研究人员对动物bHLH家族成员鉴定及其生物学功能开展了广泛的研究。文章在介绍动物45个bHLH家族名称来源的基础上, 综述了小鼠、果蝇和线虫3种模式动物bHLH家族成员及其功能的研究进展。小鼠、果蝇和线虫中分别有114、59和42种bHLH蛋白。其中, 小鼠108种、果蝇47种和线虫20种bHLH蛋白的功能已比较明确, 功能未知的22种线虫bHLH蛋白中还有15种尚未归入相应家族。文章也对部分被误用的bHLH家族成员名称做了说明, 可为相关研究人员深入开展bHLH转录因子结构与功能的研究提供较为清晰和系统的背景资料。     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。