酵母脂肪酶的制备及应用新进展

脂肪酶是工业领域应用非常广泛的一类绿色生物催化剂,由于脂肪酶可催化酯水解、酯化、转酯化、醇解和氨解等多种反应,在食品加工,有机合成,制备生物柴油等方面均得到了较为广泛的应用,是目前的研究热点.微生物是脂肪酶的重要来源之一,其中酵母脂肪酶被认为是非常安全的一类脂肪酶,也是应用最为广泛的一类脂肪酶.该文介绍了酵母脂肪酶的制备和应用研究概况,重点综述了其在多个应用领域中的最新研究进展.挖掘更多的新型高活性脂肪酶,降低脂肪酶的生产成本,提高酶的重复使用率是今后脂肪酶应用研究亟待解决的问题.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ与IgG Fc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母菌中的表达及产物分析

目的:在乳酸克鲁维酵母中表达人可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)与IgG Fc的融合蛋白。方法:首先获得sTNFRⅡ-IgGFc融合基因片段,然后构建至乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1中,获得sTNFRⅡ-IgGFc的表达载体,并将其电转化乳酸克鲁维酵母(Δura3),通过ELISA方法筛选高表达sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白的重组乳酸克鲁维酵母菌株,采用还原和非还原SDS-PAGE分析融合蛋白是否形成二聚体结构,Western印迹验证sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母(Δura3)中的表达。结果:构建了sTNFRⅡ-IgGFc表达载体pKLAC1-sTNFRⅡ-IgGFc,获得了表达sTNFRⅡ-IgGFc的乳酸克鲁维酵母菌株,SDS-PAGE和Western印迹表明该融合蛋白能自发形成类似于抗体的二聚体结构。结论:实现了sTNFRⅡ-IgGFc融合蛋白在乳酸克鲁维酵母(Δura3)中的表达。     

重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白在PichiaPink系统中的表达

目的:比较PichiaPink表达系统和巴斯德毕赤酵母GS115在表达外源蛋白方面的差异,对PichiaPink表达系统的潜在优点进行评价。方法:以重组人血清白蛋白-干扰素α2b融合蛋白(HSA-IFN-α2b)为报告蛋白,构建相关载体,分别转化PichiaPink系统菌株和巴斯德毕赤酵母GS115菌株,诱导HSA-IFN-α2b表达并测定表达水平;通过SDS-PAGE检测HSA-IFN-α2b在PichiaPink系统中的降解程度。结果:PichiaPink系统几乎所有的转化子都可以表达HSA-IFN-α2b,而GS115菌株只有60%的转化子能表达HSA-IFN-α2b;同一种Pink菌株中,整合有高拷贝数表达载体pPink-HC的菌株表达量高于整合有低拷贝数表达载体pPink-LC的菌株;Pink蛋白酶缺陷菌株在复杂培养基(YPD,BMMY)中HSA-IFN-α2b基本没有降解,而在合成培养基(BSM)中降解现象明显。结论:PichiaPink表达系统产生的转化子较GS115菌株产生的转化子易于筛选;PichiaPink系统蛋白酶缺陷菌株可明显减少外源蛋白降解。这些结果为利用PichiaPink表达系统高水平和大规模制备外源蛋白提供了实验依据。     

纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

纳豆激酶纳是从日本传统食品纳豆中发现的一类具有溶栓效果的蛋白酶,由于其具有安全,高效,作用时间长,易吸收,廉价等优点,现在正成为一个开发治疗血栓类疾病药物的研究热点。从本实验室保存的一株高溶栓的纳豆杆菌N07出发,提取总基因组DNA,利用PCR手段扩增获得了纳豆激酶长为825bp的成熟肽基因片段。构建重组表达质粒pPICZaA-NK,经EcoR I、Xba I双酶切、PCR、测序验证得出重组表达质粒上的外源基因即为825bp的目的片段;将重组质粒pPICZaA-NK用内切酶Sac I线性化后电击导入毕赤酵母X33,通过含Zeocin的YPDS平板筛选获得重组酵母。重组酵母在BMMY培养基中发酵培养,用1%甲醇诱导目的蛋白表达。用纤维蛋白平板法检测发现发酵上清具有纤溶活性,经硫酸铵盐析、透析、Sephadex-G50过柱等步骤分离得到纳豆激酶蛋白,进行SDS-PAGE鉴定表明,表达的纳豆激酶蛋白分子量为27KD。以尿激酶为标准,实验所得纳豆激酶发酵上清液溶栓活性约为195U/mL。成功的将纳豆激酶成熟肽基因在毕赤酵母X33中表达,为纳豆激酶基因工程进一步研究奠定基础。     

发酵抑制物对絮凝酵母戊糖发酵的影响

将絮凝剂加入酵母溶液中,使酵母絮凝成颗粒以此作为固定化酵母进行戊糖发酵。研究了常见发酵抑制物(甲酸、乙酸、糠醛和乳酸等)对絮凝酵母发酵木糖的影响。结果表明:在60.0g/L木糖发酵液中,经过24h发酵,木糖利用率达94.6%,当分别添加抑制物甲酸、乙酸、糠醛、乙醇和乳酸时,聚氧乙烯絮凝酵母分别对其的耐受浓度为0.5、0.5、1.0、30.0和8.0g/L。当抑制物添加量超过各自的耐受浓度后,对絮凝酵母发酵会产生明显的抑制作用。     

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

选择合适的蛋白表达系统是外源基因能否成功表达的关键.毕赤酵母(Pichia pastoris)蛋白表达系统是近些年来发展起来的一种真核表达系统,与其他表达系统相比,该系统所具有的诸多优势使其研究价值和应用价值越来越广泛,已经成功表达了多种蛋白质.简要综述其特点、表达宿主菌、表达载体以及其元件、外源蛋白的表达及其影响因素等方面的基础研究和最新进展.     

盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵栽体,进行自激活及毒性验证.以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD 18-T栽体,经测序鉴定正确后,EcoR Ⅰ/Nde Ⅰ双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母栽体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性.结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性.     

氦氖激光和亚硝基胍复合诱变选育高产乙醇的休哈塔假丝酵母

木糖的乙醇发酵一直被视为木质纤维原料生物转化产生乙醇的关键因素,休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)是木糖发酵性能较好的天然酵母之一。对Candida shehatae HDYXHT-01进行了氦氖激光诱变和NTG诱变,力求选育出发酵木糖产乙醇能力强的菌株。氦氖激光诱变得到的突变株HN-3乙醇产量为17.03g/L,乙醇得率达到0.3393g/g,相比原始菌株提高20.36%。再对HN-3进行NTG诱变,得到的突变株NTG-2乙醇产量为24.20g/L,相比HN-3提高42.10%。进而对NTG-2菌株进行了摇瓶48h连续发酵试验,测得其乙醇产量、木糖利用率、乙醇得率和乙醇产率分别达到24.16g/L,69.26%,0.4360g/g和0.7075g/(L·h)。     

60Co-γ射线诱变选育富硒酵母菌株

本试验以产朊假丝酵母菌(Candida utilis)为出发菌株,通过60Co-γ射线诱变,采用Na2SeO3抗性平板初筛和摇瓶培养复筛的方法,获得了一株高硒和高硒蛋氨酸含量的菌株CU7,与出发菌株相比,生物量达到10.58g/L、总硒提高了2.01倍.硒蛋氨酸的含量提高了2.44倍,硒蛋氨酸与总硒的比值也由49.85...     

ApCl基因在毕赤酵母中的表达

为了研究ApCl基因的功能,应用基因重组技术将ApCl基因片段克隆入大肠埃希菌—酵母穿梭质拉pGAPZαA,构建重组真核表达质拉pGAPZαA-ApCl,电转化巴斯德单赤酵母GS115,Zeocin筛选出阳性克隆转化子.通过比较转化空载体pGAPZaA和重组载体pGAPZαA-ApCl的不同菌株分别在含有高盐和高山梨醇浓度的液体培养基中生长情况,发现毕赤酵母GS115在转化ApCl基因后其抗旱、抗盐能力显著提高(约3倍),进一步验证了ApCl基因对提高生物抗逆能力有显著作用,为将来分离该蛋白及进一步研究奠定基础.