双菌深层发酵纸浆纤维产生单细胞蛋白及5’-单核苷酸的研究

产黄纤维单胞杆菌(Cellulomonas flavigena 372—24D)和腐臭假单胞杆菌(Pseudomonaspuelda 372-24M)可利异纸浆(含73．7％纤维素)作唯一碳源进行混合发酵。经过五天振荡培养,纸浆纤维素分解98％。每消耗一克纸浆可产生0．17克菌体蛋白质。氨基酸组份分析表明,此种蛋白质中含5．4％赖氨酸、7．5％精氨酸、9．1％亮氨酸和8．4％缬氨酸等。将发酵液pH调至10,60℃保温20分钟,菌体内核糖核酸(RNA)含量减少一半左右,RNA降解成单核苷酸。发酵液经过纯化可获得四种单核苷酸结晶。经纸层析、纸电泳和紫外吸收光谱鉴定,它们分别为5-腺苷酸(5’AMP)、5-尿苷酸(5’-UMP)、5’-胞苷酸(5’-CMP)和5'-鸟苷酸(5’-GMP)。本文并对双蓖纤维素发酵过程的生理生化变化进行了研究。     

人源化单克隆抗体研究进展

尽管通过几种展示文库和转基因小鼠已经可以制备人源单克隆抗体,但是人源化鼠源单克隆抗体使之用于人体治疗仍为抗体研究领域的热点。本文总结了单克隆抗体人源化的几种方法,并对其将来的发展进行了展望。     

缺乏固氮活性的浑球红假单孢菌谷氨酸合成酶突变株

光合细菌浑球红假单孢菌601菌株,经过NlG诱变获得谷氨酸缺陷型204菌株。生化分析表明,突变株204缺乏谷氨酸合成酶活性(GoGAT),谷氨酰胺合成酶话性比亲株低,用放氢和乙蛱还原法未测出固氮酶活性。此外,突变株204不能在多种氮源上生长,例如：氨、尿素、组氨酸、丝氨酸、精氨酸和腺嘌呤,表现出氮素代谢上多效缺陷的表型。从含氨基础培养基或充氮气的低限培养基上分离回复子,自发回复突变频率均为2×10一·回复子的固氮酶和GS活性恢复到亲株的水平,同时重新获得利用上述各种氮源的能力。胞内游离氨基酸库分析表明,突变株的谷氨酰胺含量是亲株的16倍,外源谷氨酰胺加入培养基也抑制固氮活性。从上述结果推论,浑球红假单胞菌具有对固氮酶调节高度敏感的反馈系统,它随代谢中间产物而变化,胞内谷氨酰胺的含量是固氮酶活性反馈调节的关键成份。     

毛萼田菁茎瘤菌（Azorhizobium caulinodans）吸氢活性缺陷株的筛…

利用转座子Ｔｎ５随机插入突变法,从毛萼田菁茎瘤菌中筛选得到两株吸氢活性缺陷突变株Ｒ－４９和Ｒ－３０９,其固氮酶活性也大大降低,约为野生型固氮酶活性的６－８％。以带有Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的５．９ｋｂ的ｈｕｐ基因的质粒ＰＨＲ１１为探针与Ａ．ｃｏｕｌｉｎｏｄａｍｓＯＲＳ５７１和Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ１２２ＤＥＳ（Ｈｕｐ）的总ＤＮＡ进行分子杂交,放射自显影表明,Ａ．ｃｏｕｌｉｎ     

浑球红细菌（R.sphaeroides）glnBA基因克隆及其物理图谱

从浑球红细菌的基因文库中筛选到ｐＨＴ３、ｐＨＴ１０及ｐＨＴ３５三个阳性克隆,其中质粒ｐＨＴ１０与ｐＨＴ３５能遗传互补英膜红细菌的谷氨酰胺缺陷型Ｇ２９,使其ＧＳ酶及固氮酶活性得到恢复,对质粒ｐＨＴ１０上的ｇｌｎＡ同源片段进行了亚克隆和限制性内切酶图谱分析,确定了浑球红细菌ｇｌｎＢ与ｇｌｎＡ之间存在连锁关系。     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

浑球红假单胞菌在暗处发酵生长时的固氮酶、吸氢酶以及放氢机制的研究

光合细菌浑球红假单胞菌(Rhodopesudomonas sphaeroides)能在黑暗厌氧条件下生长。首次发现发酵生长的浑球红假单胞菌有固氮酶和吸氧酶的活性。试验比较了在光营养、黑暗厌氧呼吸和好氧呼吸生长方式下该菌的放氢作用,认为黑暗厌氧呼吸过程中的放氢是氢酶催化的放氢。     

光合细菌Rhodobacter sphaeroides glnBlacZ 融合子的构建与表达

亚克隆了Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ ｇｌｎＢ启动子,以ｐＭＰ２２０ 为载体构建成ｇｌｎＢｌａｃＺ融合子。将ｇｌｎＢｌａｃＺ、ｎｉｆＨｌａｃＺ、ｎｉｆＡｌａｃＺ分别导入Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ 谷氨酸合酶突变株ｇｌｔＢ－ 、ｇｌｔＤ－ 和野生型菌株中,分析了突变对固氮基因转录表达的影响。试验证明,在ｇｌｔＢＤ 突变株中ｎｉｆＨ 的表达受阻遏,ｎｉｆＡ 表达水平很低。这证明ｇｌｔ 基因的突变引起固氮酶结构基因和固氮正调节基因的转录被阻遏,而ｇｌｎＢ 基因的表达几乎不受影响。试验还测定了环境中结合态氮和有机酸等信号分子对ｇｌｎＢ 和ｎｉｆＨ 表达的影响,发现加入氨或谷氨酰胺后,ｎｉｆＨ 的表达受到明显的阻遏作用,ｇｌｎＢｌａｃＺ的β半乳糖苷酶活性虽下降３０ ％ 左右但不随结合态氮浓度升高而变化,仍维持在一个较高的水平。α酮戊二酸和丙酮酸对ｎｉｆＨ 的表达有部分去阻遏作用而对ｇｌｎＢ的表达无诱导作用     

光合菌SDH2 hupT基因的突变与吸氢酶表达

利用三亲本杂交将自杀质粒ｐＳＥ８引入光合细菌Ｒｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＳＤＨ２０菌株,经过质粒上插入了ｋａｎ＾Ｒ基因的ｈｕｐＴ基因片段与受体基因组同源双交换,构建成ｈｕｐＴ插入突变株ＳＤＨＴ１和ＳＤＨＴ２。     

光合菌Rhodobacter sphaeroides 601 hupT基因的克隆与功能分析

从紫色非硫光合细菌Rhodobacter sphaeroides 601的吸氢酶（hup）基因簇中,克隆了hupT基因,并对该基因进行了测序,分析了由其推测的氨基酸序列的同源性。hupT基因全长1332bp,编码一分子量约为４８.23kD的蛋白,将hupT基因引入大肠杆菌进行了体外表达。纯化基因产物ＨupT,并进行ＨupT的自身磷酸化分析。结果表明,ＨupT属于双组份调节系统中的组氨酸蛋白激酶。将hupT基因导入光合菌Rhodobacter capsulatus吸氢酶负调节基因突变株BSE8后,野生型吸氢酶的表型得以恢复,所克隆的R.sphaeroides 601的hupT基因在吸氢酶的表达中起负调节作用。