CpTI蛋白在大肠杆菌中的高效融合表达及其纯化与活性测定

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (Cowpea Trypsin Inhibitor) 基因 (CpTI) 因其抗虫谱广及不易耐受等优点在植物基因工程中得到广泛应用。为进行遗传修饰食品（Genetically modified foods, GMF）中所含CpTI基因表达产物的安全性评价,我们需要在体外微生物体系中获得大量的CpTI蛋白。采用pGEX融合蛋白表达系统,将CpTI与GST的编码序列在大肠杆菌BL21中进行融合表达,表达产物达到菌体总蛋白的40%。经一步Glutathione Sephrose 4B亲和纯化,融合蛋白GSTCpTI纯度达到90％以上。将Thrombin蛋白酶与融合蛋白过夜作用,可获得切掉了GST标签的CpTI蛋白。活性测定显示GSTCpTI及CpTI蛋白均具有明显的胰蛋白酶抑制剂活性。用纯化的融合蛋白免疫家兔还可诱导产生高效价的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1∶20000。Western Blotting 实验显示,无论是菌体超声裂解后总蛋白中的CpTI蛋白或是经纯化后的CpTI蛋白均可与自制的抗体发生特异性结合。这为进一步进行CpTI蛋白的安全性评价工作奠定了良好基础。     

通过细胞内的靶向定位大幅度提高外源蛋白在转基因植株的积累水平

通过体外操作,对豇豆胰蛋白酶抑制剂(cpti)基因进行修饰,获得了一个融合蛋白基因(sck)。该基因是在cpti基因的基础上,在其5’端添加了信号肽编码序列,在3’端添加了内质网滞留信号编码序列,旨在引导基因转译产物进入细胞内质网,并最终滞留在内质网及其衍生的蛋白体内。用sck基因转化烟草(Nicotiana tabacum L.),对获得的转基因植株进行ELISA检测。结果表明,含有修饰基因的转基因烟草CpTI蛋白含量有明显提高,比转末修饰cpti基因烟草平均高出2倍,最高单株可达4倍以上,同时转基因植株的抗虫性也有了显著的提高。结果表明,采用外源蛋白靶向定位的策略,可大幅度提高外源蛋白在转基因植物细胞内的积累量,在植物基因工程研究中具有广泛的借鉴意义。     

苗药岩豇豆化学成分的研究

从黔产苗族习用药材岩豇豆(Lysionotus pauciflorus Maxim)中分离得到了5个化合物,经波谱数据分析,它们的结构分别为：二十九烷醇-15(nonacosan-15-ol,1),正三十烷醇(n-triscontanol,2),β-谷甾(β-stitosterol,3),岩豆素(7-dihydrox-4,6,8-trlmethoxyflavone or nevadensin,4),熊果酸(ursolic acid,5),除化合物4外,其它成分在该植物中均为首次报道。     

卡培他滨对非靶标生物斑马鱼胚胎的发育毒性研究

为评价抗肿瘤药物卡培他滨(CAP)对非靶标生物的毒性, 以斑马鱼胚胎为受试生物, 研究了CAP对斑马鱼胚胎的发育毒性及对其抗氧化酶系的影响。结果表明, 直接暴露于卡培他滨中, 造成斑马鱼胚胎死亡率和畸形率增加, 且其机能有所下降。当暴露浓度高于20 μg·L-1时, 处理后的斑马鱼胚胎死亡率和畸形率显著升高, 与对照组相比有极显著差异。CAP浓度为0.2 μg·L-1时, 超氧化物歧化酶 (SOD) 活性和过氧化氢酶 (CAT) 活性均显著升高, 表明机体遭受一定程度的氧化损伤; 当浓度高于20 μg·L-1时, SOD和CAT活性显著降低, 表明斑马鱼仔鱼所受氧化损伤超出其自我修复能力, 引发致死性伤害。本文从发育毒性及氧化应激着手, 探究了CAP对非靶标生物的潜在危害, 为其生态效应提供一定的科学依据。     

滨岸带对河流生态系统的影响机制研究进展

从水文调节、水质改善、物质输入调控、生物多样性维持等方面梳理了滨岸带对河流生态系统的影响机制。滨岸带具有良好的水文调节效应, 这种调节效应主要通过滨岸带植被根系对土壤水分持留, 植物残体对径流路径的影响, 以及挺水和沉水植物对水流的物理作用等途径实现。滨岸带显著影响水质过程, 对于面源污染径流具有较好的净化效果。滨岸带能够经历周期性的干湿交替, 同时具有发达的植被系统和丰富的土壤微生物类型, 独特的水文和地球化学条件使滨岸带成为氮磷迁移转化的热区。滨岸带对水生态系统的物质输入起到重要的调控作用, 既能够为水体生态系统提供丰富的物质来源, 又能够避免过量的营养物质输入。这种调控作用对于水生态系统群落结构的维持和生态系统功能的发挥具有重要意义。滨岸带水生和湿生植被的生长使水体生态系统食物链不断完善, 大型无脊椎生物和鱼类种群数量得以增加, 对水体生物多样性的提升具有明显的贡献。自然的洪水扰动可能是滨岸带生物多样性的维持机制, 而水媒传播过程则可能是滨岸带影响河流生物多样性的重要机制。当前对于滨岸带生态机制过程的认识尚不够深入, 今后滨岸带研究要加强物质过程和生态学过程的探讨, 尤其是水文、水质、生物群落等要素的耦合机制, 滨岸带水环境效应的模拟预测, 以及滨岸带对河流生物多样性的影响机制研究等。     

凡纳滨对虾血蓝蛋白酶解多肽的凝集与抑菌活性

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为研究对象, 通过分子筛层析、Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、凝集实验、抑菌实验和Edman N端测序等方法探索血蓝蛋白酶解多肽的凝集和抑菌活性。结果发现, 血蓝蛋白经胰蛋白酶酶解后可产生分子量约为6—70 kD的7条多肽, 该酶解混合物对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有显著的凝集活性, 与未酶解的血蓝蛋白相比, 其凝集活性可提高4—16倍。在此基础之上, 进一步分离纯化该7条多肽, 发现多肽-3对副溶血弧菌表现出较强的抑菌活性, 且具有较好的浓度依赖性。在浓度为75 μg/mL时, 其抑菌率为(93.76±1.60)%, 与阴性对照组相比, 存在极显著性差异 (P<0.01)。进一步研究显示该多肽位于血蓝蛋白N端α-螺旋区域。由此推测, 凡纳滨对虾血蓝蛋白在体外经胰蛋白酶酶解后可产生具有凝集、抑菌等免疫活性的多肽, 这对研究血蓝蛋白的降解机制及其在先天免疫中的作用具有重要意义。     

池塘分区养殖系统对水质和浮游植物群落结构的影响

通过对虾池塘内浮游植物群落结构的生态学特征指标进行连续采样监测, 研究分区养殖系统对于虾塘水质和浮游植物群落组成的影响。采用进排水管和水泵将虾塘和鱼塘相连, 通过泵出虾塘底层水和回流鱼塘上层水实现水体流动。分区组(R)由对虾单养塘和鱼类混养塘组成, 对照组(C)为对虾单养塘, 监测时间为30 天。结果显示: 通过定期循环处理可使对虾养殖池塘内总悬浮颗粒物(TPM)、颗粒有机物(POM)含量分别降低36%-45% 和15%-20%。R 组虾塘水质改善, 溶解态活性磷含量(PO₄–P)增加, 显著高于C 组(P<0.05); 实验结束时R 组虾塘NH4⁺–N 含量显著低于C 组(P<0.05)。实验期间, R 组浮游植物种类多于C 组, 均表现为绿藻门>蓝藻门>硅藻门>裸藻门; R 组蓝藻生物量低于C 组, 尤其C 组具有较高比例的颤藻。实验结束时, R 组绿藻门的优势度明显高于C 组(P<0.05); R 组浮游植物的香农多样性指数(2.91)略高于C 组(2.62)(P>0.05)。实验期间, 2个处理组浮游植物群落的Margale 丰富度指数均逐渐升高, 并且R 组在第20、30 d 高于C 组(P<0.05)。结果表明: 分区养殖可以通过减少颗粒物而改善水质, 水体流动可以加速含磷物质释放。水体流动和较低的N/P 可能有助于提高虾塘内绿藻种类优势度而减少蓝藻发生, 并且在提高浮游植物种类多样性以及丰富度方面具有积极作用。     

不同储存条件对芹菜和豇豆中硝酸盐和亚硝酸盐含量变化的影响

目的：研究不同储存时间、储存温度和包装方式对芹菜和豇豆中硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响,为居民储存蔬菜提供科学依据。方法：在不同储存温度（4℃、25℃）、储存方式（敞口包装、密封包装）下储存芹菜和豇豆7d后,采用离子色谱法测定其中硝酸盐和亚硝酸盐的含量。结果：随着储存时间的延长,2种蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐含量会逐渐增加。低温4℃密封储存时硝酸盐、亚硝酸盐含量低,变化幅度最小。25℃密封储存时硝酸盐、亚硝酸盐含量高于25℃敞口储存时的含量。4℃敞口储存时硝酸盐、亚硝酸盐含量高于4℃密封储存时的含量。结论：应尽量食用新鲜蔬菜,如若储存应选择低温密封储存,有助于减少硝酸盐和亚硝酸盐的危害。     

溶藻弧菌诱导凡纳滨对虾消减文库的构建及其表达序列标签分析

利用抑制消减杂交技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)诱导的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)血淋巴细胞cDNA文库。用DNAMAN5.2.2软件对560条高质量的ESTs进行聚类,共获得239个Unigenes。与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比较,其中66.9%为已知功能基因,33.1%为未知功能基因,GO分类将其分为7类,包括能量和基础代谢类相关的基因为第一大类占36%,免疫相关基因占15%,其他基因占8%,信号转导类占3%,抗氧化酶和凋亡相关蛋白均为2%,核蛋白类占1%。实验结果表明凡纳滨对虾在溶藻弧菌诱导下可产生一系列特异基因的表达,通过对文库的分析显示,基于PCR方法建立的SSH文库为取得大量免疫相关基因的ESTs序列提供了可能。       

凡纳滨对虾溶菌酶基因在毕赤酵母中的分泌表达和活性检测

原核重组表达的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溶菌酶蛋白主要以包涵体形式存在, 经变性和复性处理后活性仍较差。研究将凡纳滨对虾溶菌酶基因(Lvlyz基因)克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中, 电击转化毕赤酵母GS115细胞, 经组氨酸营养缺陷培养基筛选和PCR检测获得转化子。对其进行连续甲醇诱导表达, 利用SDS-PAGE和C端携带的6×His标签,对发酵液上清进行Western blot检测, 结果表明19.3 kD左右的条带即是重组表达的溶菌酶蛋白。用溶壁微球菌平板抑菌法鉴定表达产物具有较强的抑菌能力。研究首次利用毕赤酵母真核表达系统实现对虾溶菌酶基因的可溶性表达, 并且表达产物的活性良好。