发酵法生产丁二酸的化学合成培养基的筛选

以产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113 为出发菌株,针对该菌株筛选出含有关键生长因子的化学合成培养基,其关键因子为谷氨酸（Glu）、蛋氨酸（Met）和生物素（VH）和烟酸（VPP）。结合原发酵培养基中的磷酸缓冲盐成分,最终得到的化学合成培养基配方（g/L）： CH3COONa 1.36,NaCl 1.0,MgCl2 0.2,CaCl2 0.2,Na2HPO4 0.31,NaH2PO4 1.6, KH2PO4 3,NH4HCO3 1.57,Glu 0.87,Met 0.11,VH 0.010,VPP 0.025。在3 L发酵罐上进行验证实验,50 g/L初始葡萄糖发酵70 h,丁二酸的质量浓度为45.2 g/L,丁二酸收率达到90.4%。与之前的半合成培养基发酵制备丁二酸相比,丁二酸的收率提高了25.2%,副产物也有很大幅度的减少。     

聚谷氨酸-明胶生物胶生物学评价

考察了聚谷氨酸-明胶生物胶的生物性能。从细胞毒性、急性毒性、皮肤刺激、溶血、热源、皮肤致敏等试验对其进行生物学检测。结果发现：聚谷氨酸-明胶生物胶的细胞毒性、急性毒性、皮肤刺激、溶血、热源、皮肤致敏试验均为阴性。这些结果表明聚谷氨酸-明胶生物胶具有良好的生物性能。     

无溶剂体系脂肪酶动力学拆分2-辛醇及产物的非均相共沸蒸馏提取

为了提高脂肪酶在非水相中对手性仲醇的拆分效率,以2-辛醇为模式底物,建立了以辛酸为酰基供体的无溶剂脂肪酶动力学拆分手性仲醇的反应体系,采用1.5∶1的酸醇摩尔比,45℃条件下反应12 h,2-辛醇的转化率达到49.9%,并且S-2-辛醇的对映体过量率e.e.s=98.2%,反应的对映体比率E600。利用脂肪族仲醇与水形成共沸物的特性,通过非均相共沸蒸馏的方法提取拆分得到的手性仲醇,S-2-辛醇的光学纯度并未降低,并且产率大于90%,产品纯度大于98%。     

N-乙酰氨基苯磺酰氟用于柱前衍生氨基酸的毛细管胶束电动色谱分离

采用一种新型标记试剂,N-乙酰氨基苯磺酰氟（PAABS—F）作为柱前衍生试剂,建立了用毛细管胶束电动色谱分离16种常见氨基酸的方法。以硼砂-三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）二元缓冲体系为背景电解液,考察了缓冲液的pH和离子强度、表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）添加量、有机改性剂种类及分离电压等条件对分离效果的影响,实验结果表明：采用40mmol／L硼砂-Tris（摩尔比1：1）缓冲液（pH9．3）、添加140mmol／L的SDS、体积分数5％甲醇及10mmol／L三乙胺作为分离体系,可对16种PAABS—F氨基酸衍生物进行分离。     

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶活性位点的构成研究

目的:用生物信息学软件预测出N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的活性中心的金属离子结合位点.方法:选用DEPC、WRK、PMSF、NBS、DTNB 5种化学试剂选择性修饰N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶中组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、色氨酸和半胱氨酸;同时考察Co2、Fe3 、Mg2 、Mn2 、ZN2 、Ni2 、Cu2 等金属离子对酶活性的影响.结果:在DEPC、WRK修饰后,酶的活力明显下降,而PMSF、NBS、DTNB对酶的活力影响不大;说明组氨酸和酸性氨基酸为酶活性中心的必需氨基酸,而丝氨酸残基、色氨酸残基、半胱氨酸残基不参与酶活性中心的组成;Co2 对酶反应有促进作用,验证了生物信息学的预测结果;底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸对酶有较好的保护作用,保护作用随浓度增加而增加.结论:本研究为深入研究酶结构与功能的关系提供实验依据,为N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的工业应用提供理论参考.     

采用pHsh载体克隆与表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因

利用质粒pHsh为表达载体,构建高效表达N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的基因工程菌E.coli DH10B/argE-pHsh.为提高酶活并降低生产成本,优化了诱导条件.结果表明:NAOase可在pHsh系统中高活性表达,诱导起始OD600为0.6,在空气摇床中42℃热激诱导5h重组菌比酶活达到152U/mL.     

铁改性沸石对Clostridium acetobutylicum XY16固定效率及发酵性能的影响

考察4种无机铁盐改性沸石对丁醇生产菌Clostridium acetobutylicum XY16的固定效率及其发酵产丁醇性能的影响。结果表明:铁改性沸石对菌体的固定效率均优于未改性沸石,而Fe3+改性效果优于Fe2+,经FeCl3改性的沸石对菌体具有良好的吸附作用,当Fe3+-zeolite用量为180 g/L时,细胞的固定效率达到87%。在此基础上,比较了沸石负载的铁离子量对丁醇发酵性能的影响,沸石负载的铁离子量为6.0 mg/g时可显著提高丁醇发酵性能,当葡萄糖质量浓度为60 g/L时进行发酵,丁醇产量为13.5 g/L,总溶剂可达20 g/L,总溶剂的生产速率为0.385g/(L.h),比游离细胞发酵分别提高了9.5%、10.3%和40%。     

舟形藻生长、品质特性及转化筛选标记研究

研究了舟形藻(Navicula tenera)细胞表型和积累模式,利用索式抽提法和气质联用(GC-MS)方法对其进行总油脂含量和脂肪酸组分的分析,并研究了舟形藻对氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、草胺膦(PPT)、庆大霉素(Gen)、链霉素(Str)、遗传霉素(G418)、潮霉素(Hyg)以及氯霉素(Cm)这8种常用抗生素的敏感性.结果显示,舟形藻细胞以沉积底部的生长模式积累;其总油脂含量占其干物质重量的8.31%,脂肪酸种类主要有C16:0,C16:3(n-4)和C20:5(n-3)(EPA),分别占总脂肪酸的64.13%、15.87%和19.62%;舟形藻对Cm和G418非常敏感,对Hyg较敏感,而对不同浓度的Amp、Kan、Gen、Str以及PPT极不敏感.为舟形藻基因工程筛选标记的确立,进而建立其遗传转化系统奠定了基础.     

固定化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶拆分消旋蛋氨酸

基因工程菌BL21/pET22b-argE可高效表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。将含酶细胞包埋于海藻酸钙凝胶中制成固定化细胞酶,用于消旋蛋氨酸的拆分,并将其拆分能力、拆分速度及操作稳定性与游离细胞酶相比较。结果表明:单批次转化固定化细胞酶的拆分能力和游离细胞酶相近,拆分速度较慢;但多批次转化的操作稳定性显著高于游离细胞酶。重复利用8次后的固定化细胞酶仍保有95%以上的酶活力,重复利用5次后的游离细胞酶活已降至20%左右。每克湿菌泥在游离和固定化条件下重复拆分产L-蛋氨酸的量分别为74.16mmol和241.93mmol。酶拆分液中的L-蛋氨酸经重结晶后光学纯度为98.3%。固定化细胞酶比游离细胞酶更具有工业化应用的潜质。     

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育及铵离子对其生长代谢的影响

经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含61～242mmol/LNH4+梯度平板中,筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含121mmol/LNH4+发酵培养基中,琥珀酸产量达32.68g/L,转化率为65.4%,比出发菌提高了180.5%。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响,结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率,但当超过一定量后菌株生长受到抑制,不同铵盐对菌株的抑制程度不同,硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为:215mmol/L、265mmol/L、235mmol/L、210mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响过程,在3.0L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵,结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制,生物量能够达到正常水平,但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显,导致菌株生长提前结束,耗糖不完全,产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。