响应曲面法优化方格星虫多糖提取工艺

为了优化提取方格星虫多糖工艺实验条件,本研究以海南三亚海域方格星虫为主要原料,用胰蛋白酶作为酶解酶,在单因素实验基础上,采取响应面法研究超声波辅助酶法提取方格星虫多糖最佳工艺条件;探讨了p H值、液料比、超声波时间、酶底比、超声波温度、超声波功率、反应时间等7个因素的交互作用及其最佳水平。结果表明在超声波辅助酶法提取方格星虫多糖的实验过程中,单因素的最佳条件酶底比为2.5%、温度为50℃、浸提时间为2 h、料液比为1:17 g/m L、超声时间为1 h、pH值为8、超声功率为960 W,多糖的最大提取率为3.24%。该方法实验条件要求不苛刻,浸提时间短,提取率高,是一项新的实验尝试,实验结果为优化方格星虫的多糖提取理论参考。     

基于线粒体COⅠ基因序列的东南沿海可口革囊星虫遗传多样性分析

为了解我国东南沿海可口革囊星虫自然群体的遗传多样性及遗传结构, 以线粒体COⅠ基因为分子标记, 对浙江象山(XS)与温岭(WL)、福建宁德(ND)、广东湛江(ZJ)4个可口革囊星虫自然群体的80个样本的COⅠ基因片段进行PCR扩增、序列测定和分析。结果表明, 在815 bp长度的核苷酸片段中, A、T、C、G碱基的平均含量分别为29.8%、31.0%、22.6%和16.6%, A+T含量(60.8%)高于C+G含量(49.2%), 表现出较强的AT偏好性。共检测到29个核苷酸变异位点, 定义了29种单倍型, 总群体单倍型多样性指数(H_d)、核甘酸多样性指数(P_i)及平均核苷酸差异数(K)分别为0.932、0.0036及2.8902, 表现出高的H_d和低的P_i。单倍型邻接关系树的拓扑结构简单, 未呈现明显的地理谱系结构。群体内的遗传距离为0.0027—0.0040, 群体间的遗传距离为0.0032—0.0040。两两群体间的遗传分化系数(F_st)和分子方差分析(AMOVA)表明, 可口革囊星虫的遗传变异主要来自于群体内, 而群体间无显著分化。中性检验和核苷酸不配对分布结果揭示, 可口革囊星虫经历了群体历史扩张事件, 大致发生在4.6万年前的更新世晚期。     

光裸星虫ISSR-PCR反应体系的单因素优化试验

以光裸星虫为试验材料,通过单因素方法对影响其ISSR-PCR扩增效果的因子(模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶、甲酰胺和二甲基亚砜)浓度进行研究。确立适合光裸星虫ISSR-PCR的反应体系:25μL体积含1×PCR buff-er、模板DNA用量为10-50 ng、TaqDNA聚合酶为0.75-1.75 U、Mg2+浓度为1.5-2.5 mmol/L、dNTP浓度为0.20 mmol/L,引物浓度为0.8-1.2μmol/L,甲酰胺和二甲基亚砜的添加并不能优化光裸星虫ISSR-PCR反应结果。利用所建立的体系对广西北海群体的20个光裸星虫个体基因组DNA进行ISSR-PCR扫描,结果表明,优化后的体系均能扩增出清晰、多态性高的条带。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

星虫胶原蛋白的生物学特性研究

本文研究了胶原蛋白的生物学特性.结果显示,胶原蛋白溶液的粘度随浓度的增大而增大,随着温度的升高而下降;酸性条件下,粘度总体呈下降趋势,碱性时粘度变化不大;外加中低浓度的电解质与非电解质对胶原蛋白溶液粘度的影响不显著,溶液的流变学特性相对稳定.星虫胶原蛋白对小鼠皮肤无致敏反应,对创面愈合有明显的促进作用,该胶原蛋白不仅可以应用于食品与化妆品行业,还可以进一步应用于生物医学材料等领域.     

可口革囊星虫体内纤溶酶的初步研究

目的从可口革囊星虫中寻找到纤溶酶,并对其进行初步研究。方法采用匀浆、抽提离心、Sephacryl S-300凝胶过滤等方法对可口革囊星虫纤溶酶初步分离,用纤维蛋白平板法和合成发色底物法检测其纤溶活性,并用该酶进行体外溶血凝块实验。结果可口革囊星虫内脏中存在纤溶酶。此酶既直接降解纤维蛋白又间接激活纤溶酶原,它对体外血凝块有明显溶解作用。结论可口革囊星虫内脏中存在着一种既具直接降解纤维蛋白作用又具激活纤溶酶原作用的纤溶酶。     

可口革囊星虫受精过程及早期卵裂的细胞学变化

为探究可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)受精过程中精子入卵、极体排放、雌雄原核的形成与结合以及早期卵裂的特点,为胚胎发育机制研究奠定基础及指导人工育苗,显微观察了可口革囊星虫卵母细胞的形态;用荧光染色剂HOECHST33258对已固定的成熟卵及受精卵进行染色的方法,在荧光显微镜下观察了可口革囊星虫受精过程及第一与第二次卵裂的细胞学变化。成熟卵呈椭圆形,卵膜较厚,核区偏位,染色体排列整齐。在水温30℃-31℃、盐度23条件下,授精后5min-10min,精子完成入卵;授精后10min-20min,完成第一次减数分裂、释放第一极体;授精后20min-30min,完成第二次减数分裂、放出第二极体,部分受精卵的第一极体分裂为二;授精后30min-40min,雌、雄原核形成,并相互靠近向卵中央迁移;授精后40min-50min,雌、雄原核在卵中央结合成合子核;授精后50min-70min及70min-90min分别完成第一及第二次卵裂。可口革囊星虫的受精过程及早期卵裂的细胞学特点为:1)成熟卵是处在第一次减数分裂中期的初级卵母细胞,具有受精能力;2)精子入卵位点是随机的,存在多精入卵现象;3)雌、雄原核以融合方式结合成合子核;4)第一及第二次卵裂均为经裂、不等裂。     

可口革囊星虫不同组织同工酶的比较

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,研究了可口革囊星虫5种组织(收吻肌、吻、肠、肾管及体壁)10种同工酶(ADH、GCDH、SDH、EST、LDH、ME、POD、SOD、MDH、CAT)的表达。结果表明:除CAT外,其余9种同工酶均得到了较为清晰的酶谱,除SOD和MDH在5种组织中表型相同外,其它7种同工酶的表达均具有明显的组织特异性。SDH-2、EST-1、LDH-1和POD-1为收吻肌所特有;ADH-3、ADH-4、GCDH-2、GCDH-4、GCDH-5、EST-10和LDH-6均为吻所特有;EST-4为肾管所特有。在肠中,ADH和GCDH均没有检测到活性。初步探讨了5种组织中各种同工酶的分布与活性及其与各组织生理功能的关系。     

可口革囊星虫消化道的形态结构特征

采用解剖及组织学显微技术观察研究了可口革囊星虫消化道的形态及组织学结构特征。消化道始于口,经咽、食道、游离肠、螺旋肠(上行肠及下行肠)、直肠,止于肛门,各段从内向外均由粘膜层、粘膜下层、肌层及外膜组成。粘膜层表面具微绒毛及纤毛,微绒毛增加了消化道的表面积,纤毛的摆动有利于消化道内食物或消化后残渣的运送;螺旋肠及直肠的粘膜层中均有杯状细胞,在下行肠前段与中段及上行肠前段与直肠中尤其多,杯状细胞能够分泌粘液,保护粘膜上皮,润滑食物及残渣。粘膜下层为结缔组织,肌层为环肌,外膜为浆膜。肠沿纺锤肌盘绕的特点延长了食物的滞留、消化和吸收时间,弥补了缺乏消化腺的不足。肠各段除直肠肌层较厚外,其余各段肌层薄或不明显。