转新型双抗虫基因棉花的遗传分析

首次用含合成的BtCrylAc活性杀虫蛋白嵌合基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体,通过土壤根癌杆菌介导转化棉花品种冀合321,获得一批抗虫的转化再生棉花植株。利用叶片涂抹卡那霉素、叶片离体养虫和PCR扩增等检测方法对6个不同转双抗虫基因株系的抗虫性进行遗传分析。结果显示,转化株系自交的T1抗虫性状遗传较为复杂;农杆菌介导获得的转基因抗虫棉在早期世代不易选到纯合系,但是随着对抗虫性状进行单向选择,到T4和T5就能获得抗虫纯合系。利用抗虫性稳定的转化后代材料和转化受体进行田间杂交,发现F2抗虫性分离完全符合一对或两对显性基因的分离规律,并证明了DR248和DR193两个材料为外源基因双拷贝插入。转化株系的Southern杂交也证明了上述结果。     

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆(Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草(Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5 kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系"南29"中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探针对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同.     

植物多肽抗生素研究进展

植物多肽抗生素是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制或杀灭作用的小分子多肽. 根据多肽抗生素的氨基酸序列及二级结构,可将植物多肽抗生素分为9类,包括硫素（thionins）、植物防御素（plant defensins）、转脂蛋白（lipid transfer proteins, LTPs）、橡胶素（heveins）、打结素（knottins）、凤仙花素(1b-AMPs)和新近发现的荠菜素（shepherdins）、蜕皮素（snakins）、环肽（cyclotides）. 对近年来植物多肽抗生素的分类、抗菌机理、生物活性及基因工程等方面的研究情况作一介绍,希望有助于我国在这一领域的研究与开发.     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

T-DNA标签在转基因水稻基因组中的整合特点

利用热不对称交错PCR (TAIL-PCR),对200个含T-DNA插入的转基因水稻株系进行分析,获得了159个T-DNA右边界侧翼序列. 其中,92个序列含有T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列,78个序列与已公布的水稻BAC/PAC克隆有97%～100%的同源性,从而可作为T-DNA标签定位在水稻的12条染色体上. 结合先前定位的169个T-DNA标签,对T-DNA在水稻基因组中的整合特点进行了分析. 结果发现,在T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列的连接处,14.6%的T-DNA标签含有3～74bp的填充序列. 在不含填充序列的连接处,21.3%的T-DNA标签,在整合后的T-DNA右边界与侧翼的水稻基因组序列之间显示出3～5 bp的微同源性. 填充序列和微同源性的存在,揭示了T-DNA在水稻基因组中的整合既存在双链断裂修补机制,又存在单链裂缝修补机制. T-DNA倾向于整合到富含A/T核苷酸的基因组区域,即主要在基因的5′和3′端调控区以及内含子中.     

苋菜凝集素基因的克隆及在转基因烟草中抗蚜性研究

通过ＰＣＲ从苋属植物千穗谷（Ａmaranthus hypochondriacus)的总ＤＮＡ中扩增出苋菜凝集素（ＡＨＡ）的核基因片段。序列分析结果表明该基因为２４５３bp,含有－１５３８bp的内含子和两个分别为２１２bp和７０３bp的外显子。采取反向ＰＣＲ的方法获得仅含该基因的编码区克隆。以此为基础与二元表达载体pBin438构建含内含子与不含内含子ＡＨＡ基因的植物表达载体pBAHAg和pBAHAc并通过土壤农杆菌介导转了化烟草,转化再生植株的ＰＣＲ和Southern blot分析表明,ＡＨＡ基因已整合到烟草的染色体中,有单贝和多拷贝的整合。用与ＡＨＡ蛋白高度同源的ＡＣＡ蛋白的抗血清进行了免疫斑点（Immunodot blot)检测,结果初步表明转基因烟草有ＡＨＡ蛋白的表达,虫试结果表明转pBAHAg和pBAHAc烟草对蚜虫的平均抑制率分别达５７．２％和４８．８％,有的高达９０％以上,含内含子和不含内含子的ＡＨＡ基因在转基因植株中的抗蚜性不同。     

电脉冲穿孔法将苏云金杆菌δ－内毒素基因导人野生型芽孢杆菌

利用电脉冲穿孔法将带有苏云金杆菌毒蛋白基因的穿梭质粒导人几株野生型芽孢杆菌中。它们是野生型的蜡状芽孢杆菌、短芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。通过观察在新霉素和氨苄青霉素平板上长出的抗性菌落数t计算出转化效率为10¹一10¹转化子/μgDNA。从转化子中分离到的质粒DNA大小及其用HindⅢ酶切的片段与原始质粒DNA相同,毒性测试表明重组转化子对烟青虫六天的致死率达90—100％。     

抗虫转基因欧洲黑杨的培育

用带有３５Ｓ－Ω－Ｂｔ－ＮＯＳ嵌合基历的双元载体的农杆菌ＬＢＡ４４０４转化欧洲黑杨的叶片外植体,共独行５４株转化再生植株,用这些再生植物对杨尺蠖进行毒力测定,昆虫校正死亡率在８０－９６％的再生植株占总测定植株的１５％。部分再生植株对舞毒娥进行测定,表明在５－９天内校正死亡率高达１００％,存活昆虫的生长和发育也明显地受到抑制。根据苗木在苗圃中高生长的昆虫校正死亡率采用重心聚类法进行分析。初步选出高生     

导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β-1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。     

高效抗细菌植物表达载体的构建

噬菌体T7 DNA用AvaⅡ酶解后,PCR扩增获得T7溶菌酶基因.DNA序列分析表明,T7溶菌酶基因的核苷酸序列与国外发表的序列有99.5%的同源性,推测的氨基酸序列完全一致.又用PCR法改造了克隆于pUC19中的烟草病原相关蛋白1b(PR-1b)的信号肽基因和抗菌肽Shiva-Ⅰ基因,将信号肽基因分别融合于T7溶菌酶基因和Shiva-Ⅰ基因的5’末端,并将两个融合基因分别置于一个植物表达载体中的两个表达框架内,以使转基因植物中T7溶菌酶基因和Shiva-Ⅰ基因同时表达且表达产物可分泌到细胞外.本工作为用植物基因工程方法培育抗细菌转基因作物打下了基础.