氨基酸定性分析技术的一些改进 Ⅰ.快速水解和高温滤纸层析

(1)提供了一种快速水解液,蛋白貭或多肽完全水解仅需20分鉀至2小时,其配制方法是:12NHCl:85%甲酸:水=2∶1∶1。水解温度160—180度。(2)提供了氨基酸高溫层析法及正丁醇:呲啶系統可在4小时內完成单向层析,10小时內完成双向层析,其溶剂系統各成分的比例如下: 酸性溶剂系統:(1)正丁醇:85%甲酸:水=15∶3∶2。(2)正丁醇:冰醋酸:95%乙醇:水=4∶1∶1∶2。溶剂(1)适用于单向层析和双向层析的第一向,溶剂(2)适用于单向层析。硷性溶剂系統:正丁醇:呲啶:60%乙醇:水=5∶1∶1∶1。此溶剂适用于双向层析的第二向。(3)高溫层析的温度有二种:(1)在40—45度进行(2)60度进行一半移室温完成。前者較易操作,重复性也較強。(4)引用了等的吲(口乃木)醌显色法,对氨基酸的分辨极有帮助,并发現一些氨基酸的衍生物或多肽也均显不同顏色。(5)經选择后的新华定性滤紙层析效果頗佳。     

炭疽毒素受体ATRcDNA的合成和克隆及ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体的构建

可溶性炭疽毒素受体(sATR)可以特异性结合炭疽毒素保护抗原(PA),为获得用于中和炭疽毒素以防治炭疽感染的候选抗毒素药物,构建了表达ATRFc抗体样分子融合蛋白的真核表达载体。将全长为681bp的编码炭疽毒素受体N端1～227氨基酸的基因分成长约50～60碱基的18个寡核苷酸片段,相邻片段重叠部分为20～22个碱基,利用重叠延伸PCR和引物PCR法,将合成的片段组装与扩增,得到了含有ATR_1～227的全部编码区和HindIII、BamHI位点在内的DNA片段。回收的基因片段经BamHI/HindIII双酶切连接到pUC19质粒中,挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定,获得了全序列正确的克隆。将ATR基因与Fc基因连接后插入pcDNA3.1载体多克隆位点HindIII和NotI之间,得到表达ATRFc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATRFc,为利用CHO哺乳动物细胞表达ATRFc并研究其生物学性质奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白EspB 在RAW264.7细胞中的稳定表达

[目的]建立能够稳定表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白EspB(Rv3881c)的RAW264.7细胞系,为研究EspB蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用提供科学依据.[方法]首先成功构建的重组质粒pEGFP-C1-EspB,然后将重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1以脂质体介导的方法转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7中,经过G418筛选后建立稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系,并通过RT-PCR、荧光显微镜及Western blot方法,在基因和蛋白两个水平对所建立的稳转细胞系进行鉴定.[结果]EGFP-ESAT6融合基因成功整合入RAW264.7细胞基因组并能够稳定表达,成功获得了能够稳定表达EGFP-EspB融合蛋白以及EGFP的细胞系.[结论]本试验利用脂质体介导的方法,将构建的重组载体pEGFP-C1-EspB和空载体pEGFP-C1转染至Raw264.7细胞系中,获得了稳定表达EGFP-EspB融合蛋白的巨噬细胞系,为阐明EspB分泌蛋白在调控巨噬细胞功能中所起的作用以及EspB与巨噬细胞蛋白之间的相互作用提供了研究平台.     

炭疽疫苗及治疗药物筛选和评价模型研究进展

炭疽疫苗和治疗药物的研究是近年来国际上研究热点之一,由于对它们的有效性研究不能在人体进行,因此实验模型的选择就特别重要.目前常用的细胞模型主要包括CHO细胞和J774A.1细胞.动物模型种类较多,包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等都被作为炭疽的动物模型加以研究.由于模型选择的差异,实验结果常出现较大差异,甚至得到相反的结果.回顾了以往在细胞和动物模型上进行的炭疽实验,分析选择炭疽研究模型的原则和依据.同时,为探讨不同模型之间产生实验结果差异的原因,简要介绍了炭疽杆菌的致病机理,以及炭疽疫苗和治疗药物的研究进展.     

杀菌/通透性增加蛋白(BPI)研究进展

杀菌/通透性增加蛋白（BPI）是人中性粒细胞中存在的一种碱性蛋白,它能与革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）结合,具有中和内毒素和杀灭细菌作用。在革兰氏阴性菌感染的治疗方面有良好的发展前景,本文主要就BPI的生理功能,作用机理及临床研究方面的进展作一综述。     

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR_Fc在CHO细胞中的表达

ATR-Fc是人炭疽毒素受体（ATR）的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1-227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3-1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA31/ATR9Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO-K1细胞中,用G418筛选并获得ATR-Fc表达水平为10～15μg/(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR-Fc-1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR-Fc与PA的亲和性,表明ATR-Fc可与PA特异性结合。     

炭疽毒素受体胞外区在毕赤酵母中分泌表达、纯化与活性鉴定

使用分泌型表达载体,实现了重组炭疽毒素受体胞外区 (rATR(CMG2)-EXCELL) 在毕赤酵母 KM71H 培养物上清中的分泌表达 . 表达量约占培养物上清总蛋白质的 20%. 经过螯合柱初步纯化,每升诱导培养物可获得约 1 mg 电泳纯的 rATR(CMG2)-EXCELL. 体外与配基 PA 结合试验和细胞保护试验显示, rATR(CMG2)-EXCELL 具有很好的生物活性 . rATR(CMG2)-EXCELL 的成功表达为今后研究炭疽毒素受体的作用机理、发展新型炭疽治疗药物打下基础 .     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达及膜定位研究

从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出ESAT-6基因,克隆入pET21a(+)载体.将成功构建的pET21a(+)-ESAT-6重组质粒转化入感受态BL21(DE3)中,经诱导表达后,使用SDS.PAGE和Western blot鉴定.超声破碎后发现目的蛋白以可溶性表达形式存在,经过Ni-NTA柱和DEAE-Seph...     

抗炭疽保护性抗原单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析

目的:克隆并分析抗重组炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)单克隆抗体4B2、5E1和2A8轻、重链可变区基因。方法:从分泌抗rPA特异性单抗的杂交瘤细胞株4B2、5E1和2A8中提取总RNA;利用RT-PCR技术克隆抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,并将其连入pMD18-T载体中进行测序分析。结果:4B2VL基因全长378bp,VH基因全长414bp;5E1VL基因全长420bp,VH基因全长426bp;2A8VL基因全长384bp,VH基因全长342bp。通过分析,这些基因均符合小鼠IgGV区基因的特征,含有4个框架区、3个抗原互补决定区,而且抗体特征性的半胱氨酸残基的数量和位置也正确。结论:克隆了抗rPA单抗4B2、5E1和2A8的VL、VH基因,为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。     

结核分枝杆菌ESX分泌系统研究进展

在结核分枝杆菌中存在能够使某些蛋白通过其高度疏水和通透性极差的细胞壁的分泌系统,其中ESX-1分泌系统负责ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kD）和CFP-10（culture filtrate protein of 10kD）的分泌．这两种蛋白能够形成1：1的二聚体结构,并且是结核分枝杆菌重要的毒力因子．近年来陆续发现其他一些蛋白也由ESX-1分泌系统所分泌．在结核分枝杆菌中还存在其他4种类似ESX-1的分泌系统ESX-2～ESX-5．ESX分泌系统也在其他革兰氏阳性菌和放线菌中被发现,有学者按照公认的术语称其为Ⅶ型分泌系统．本文综述了结核分枝杆菌ESX分泌系统的组成和分子机制,以及分泌蛋白与宿主的相互作用等方面的研究进展．