酵母杂交系统在CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶率研究中的应用*

目的:为提高CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)靶向性奠定基础,同时证明酵母杂交系统在研究CRISPR/Cas9脱靶效应中的应用价值。方法:以实验室前期构建成功的activase基因编辑水稻株为研究对象,先采用T7核酸内切酶Ⅰ法初步预测30株基因编辑水稻株的脱靶率。随后以酵母杂交系统进一步预测脱靶率以及研究sgRNA结构对脱靶率的影响。首先,将activase靶向基因的标准sgRNA(standard sgRNA)和短sgRNA(truncated sgRNA)分别克隆至CRISPR/Cas9系统表达载体pDW3769中,构建对应的重组载体pHZ2和pHZ4,转化至YPH499酵母单倍体形成重组酵母YpHZ2和YpHZ4;其次,根据脱靶位点预测选择7组脱靶序列A、B、C、D、E、F、G以及靶向序列,分别克隆至包含报告基因mCherry的高拷贝载体pDW3133和低拷贝载体pDW3134,构建相应的高拷贝重组载体pHZ5、pHZ7、pHZ9、pHZ11、pHZ13、pHZ15、pHZ17和pHZ19,以及对应的低拷贝重组载体pHZ6、pHZ8、pHZ10、pHZ12、pHZ14、pHZ16、pHZ18和pHZ20,转化至YPH500酵母单倍体,构建重组酵母YpHZ5-20。随后,重组酵母YpHZ2和YpHZ4与重组酵母YpHZ5-20分别杂交,挑取双倍体酵母菌落,在不同的时间段下检测荧光数值,根据荧光值定量预测脱靶率。结果:酵母培养144~192 h时荧光最为显著,脱靶序列sgRNA与靶向基因sgRNA同源性越高,越易造成脱靶,但短sgRNA较标准sgRNA脱靶率低。根据水稻植株的脱靶检测显示脱靶率约20%,基于酵母杂交的检测结果显示脱靶率为20%~28%。结论:酵母细胞进入稳定期时荧光值最为显著,且与载体的拷贝数量成正比。sgRNA序列以及长短结构可影响CRISPR/Cas9的基因靶向性。两种方法的脱靶率预测结果相当,表明酵母杂交系统在评价CRISPR/Cas9系统的脱靶率以及研究脱靶影响因素中具有良好的应用价值。     

基于稳定氧同位素确定植物水分来源不同方法的比较

利用稳定同位素技术确定植物水分来源,对提高生态水文过程的认识和对干旱半干旱区的生态管理至关重要。目前基于稳定同位素技术确定植物水分来源的方法众多,但不同方法之间对比的研究较少。本研究基于原位样品采集,室内实验测试,利用直接对比法、多元线性混合模型(IsoSource)、贝叶斯混合模型(MixSIR、MixSIAR)和吸水深度模型分析植物水分来源,并对比各方法的优缺点。结果表明:相对于多元线性混合模型(IsoSource)而言,贝叶斯混合模型(MixSIR、MixSIAR)具有更好的水源区分性能,但对数据要求较高,且植物木质部水和潜在水源同位素组成的标准差越小,模型运行结果的可信度更高。本研究中贝叶斯混合模型(MixSIR)为最优解。在利用稳定氢氧同位素技术确定植物水分来源时,可先通过直接对比法定性判断植物可能利用的潜在水源,然后再用多元线性混合模型(IsoSource)、贝叶斯混合模型(MixSIR、MixSIAR)计算出各潜在水源对植物的贡献率和贡献范围,必要时可评估模型性能,选择出最优模型,定量分析植物的水分来源。若植物主要吸收利用不同土层深度的土壤水,可结合吸水深度模型计算出植物吸收土壤水的平均深度。本研究为干旱半干旱地区利用同位素技术确定植物水分来源方法的选择提供了理论依据。     

73例中国人血友病甲基因突变的分析

我们用Southern blotting、PCR、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和DNA测序等方法对73例血友病甲患者(经上海瑞金医院测定血浆FVⅢ:C和vWF:Ag诊断,其中无亲缘关系患者65例,按FVⅢ:C水平分为轻、中、重三型。FVⅢ:C< 2%为重型,共47例;FVⅢ:C 2%-5%为中型,共9例;FVⅢ:C5%-25%为轻型,共1 7例)进行FVⅢ基因突变检测。共检出内含子22倒位23例,均为重型,约占重型的49%,与国外报道相似。余下50例(其中无亲缘关系者45)用PCR-DGG E分析所有外显子及其侧翼内含子序列,发现异常条带则进行DNA测序。在17例患者中检出突变13种,其中无义突变5种,均为重型;错义突变6种,除1例外都是轻中型;小缺失2例,都是重型;其中,AA466Lys(AAG)-Thr(ACG)、719Tyr(TAC)-Stop(TAG)、AA826 Asp(GAC)-Glu(GAA)、312Ile(ATC)-xxC及AA1551-1552del(AGAA)为新发现的突变。有亲缘关系的患者都有相同的基因突变,而在无亲缘关系患者未发现相同突变。基因突变与临床表现基本相符。 Abstract:We use Southern blotting,PCR,denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)and DNA sequencing to detect gene mutations of haemophilia A in Chinese population.73 cases(47 severe)(FVIII:C<2%),9 moderate(FVIII:C 2%~5%),17 mild(FVIII:C 5%~25%)of haemophilia A were first screened with Southern blotting,23 were found to be the intron 22 inversion type,all being severe cases.The remaining 50 cases without intron 22 in version were examined with PCR-DGGE.Genomic DNA were amplified using GC-clamped primers covering all the exons and all flanking intron regions.Abnormal bands were sequenced.13 different mutations were identified,including 5 nonsense mutations,6 missense mutations and 2 small deletions.5 mutations,AA466Lys(AAG)-Thr(ACG),AA719Tyr(TAC)-Stop(TAG),AA826Asp(GAC)-Glu(GAA),AA312Ile(ATC)-xxC and AA1551-1552del(AGAA)have not been reported before.Generally the genetic defects correspond to the clinical conditions.     

孤独症患者的偏才和获得性偏才现象及其神经生物学机理

孤独症是一种病因复杂、临床表现多样、与早期发育密切相关的儿科常见病,严重影响患者的学习和日常生活能力,但部分患者却伴有某种超常的技巧或才能,即所谓"孤独偏才"现象。与此相关的另一罕见现象是,某些人在中枢神经系统受伤后也表现出某种特殊的技巧或才能,即所谓"获得性偏才"现象。研究资料表明,这两类偏才的神经生物学变化原理有许多共同之处。本文简介这两类偏才现象,并进一步分析其神经生物学原理,以帮助人们对这些特殊大脑功能活动的了解。     

铁皮石斛不同授粉方式对蒴果发育及种子萌发的影响

为研究不同授粉方式对铁皮石斛蒴果发育以及无菌播种种子萌发的影响,选用健康的铁皮石斛植株花朵进行了自花授粉、异花授粉和自然授粉;选用不同种龄的种子在离体培养条件下进行萌发实验。研究结果表明:铁皮石斛自花授粉和异花授粉均能结实,异花授粉的结实率较高,达64.8%;铁皮石斛在开花的第2~3天授粉的结实率最高;120~210 d种龄的种子萌发率较高,均为90%以上。选择人工异花授粉和适宜种龄的种子离体培养,不仅可培育优良品种,还可缩短繁殖周期,为铁皮石斛遗传改良提供依据。     

缅甸传统医药与民族植物学

正缅甸位于中国、孟加拉国和印度之间,是中华文化、印度文化和伊斯兰文化的交汇处,因此其传统文化具有极高的多样性。同时,缅甸又是以佛教文化为主流、以缅系各族(如巴玛人、茵达人、东友人)、傣族(傣龙、傣勒)和克钦族(如景颇人和载瓦人)等汉藏语系族群为主体的国家,可见缅甸的传统文化又有极大的统一性。因此,作为民族植物学的研究对象——人与植物的关系,其科学研究意义十分重大。     

基于斑块尺度的神农架川金丝猴生境适宜性评价

基于斑块尺度的生境适宜性研究,可以通过物种分布的景观格局特征,推导出研究区的景观适宜性,有利于景观规划决策。研究首先分析农业用地对神农架川金丝干扰的阈值,其次采用泊松回归构建基于斑块尺度的包含植被类型、斑块特征和人为干扰特征的猴群分布模型,依据模型结果叠加道路适宜性分级图对川金丝猴适宜生境进行评价。结果显示:(1)农业用地干扰阈值为2000 m;(2)最优模型显示猴群偏好面积大、形状简单的寒温性针叶林、寒温性针叶-落叶阔叶混交林、温性针叶-落叶阔叶混交林斑块,对农业用地具有回避性;(3)道路干扰已成为川金丝猴迁移的主要障碍,川金丝猴分布区受到的农业干扰较小,但其成为阻碍川金丝猴扩张分布区的屏障。建议神农架保护区全面开展道路与旅游景点对野生动物干扰的监测。     

尼古丁对兔成骨细胞生物学性能的影响及维生素C的拮抗作用

为了探究不同浓度尼古丁对体外细胞增殖分化的影响以及维生素C对尼古丁的生物学作用的影响,该文以兔成骨细胞为实验材料,对细胞增殖和各项分化指标进行了检测。MTT结果显示：与空白对照组相比,1×10-6,1×10-5mmol/L尼古丁组有促细胞增殖的作用,但是高浓度尼古丁（1 mmol/L）组对细胞增殖有明显的抑制作用。RT-PCR检测发现：用低浓度尼古丁处理细胞,ALP、COLI和OCN的基因表达上调;相反,高浓度尼古丁下调了细胞ALP、COLI和OCN的表达。ALP染色和Von Kossa钙结节染色也显示出高浓度尼古丁对成骨细胞的毒性作用。加入维生素C后,1 mmol/L尼古丁组对成骨细胞增殖和各基因表达的影响有所改善,类似的结果也见于ALP染色和Von Kossa染色。由此证实,极低浓度尼古丁对成骨细胞确有促进增殖、增强ALP活性和上调ALP、COLI、OCN基因表达的作用;但是,高浓度尼古丁却有相反的作用,抑制成骨细胞的增殖和分化。同时,维生素C具有部分拮抗高浓度尼古丁对成骨细胞毒性作用的能力。     

亚高温下不同空气湿度对番茄光合作用和物质积累的影响

为了研究亚高温下不同空气湿度对番茄植株光合作用及物质积累的影响,本试验利用人工气候室,在11:00—15:00平均温度为33℃的亚高温条件下,设置3个空气相对湿度处理,分别为70%～80%(高湿)、50%～60%(中湿)和不加湿的30%～40%(低湿)。结果表明:在处理25d时,高湿处理番茄叶片叶绿素含量、净光合速率显著高于低湿处理,而低湿处理果实空洞率比高湿处理高18.4%(P<0.05);在33℃亚高温条件下,70%～80%的相对湿度有利于光合作用的增强和果实品质的提高。     

豚鼠I型前庭毛细胞胆碱能受体通道特性

本文旨在探讨豚鼠I型前庭毛细胞上有无胆碱能受体存在,并对其相应的离子通道特性进行研究。应用全细胞膜片钳技术检测急性分离的豚鼠I型前庭毛细胞对乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的反应。结果显示,7．5％（21／279）的I型前庭毛细胞对10-1000μmol／L ACh敏感,引发明显的外向电流。该电流对ACh的反应呈浓度依赖性,半数激活浓度（EC50）为（63.78&#177;2．31）μmol／L,但该电流为非电压依赖性。在-50mV钳制电压和正常细胞外液中,100μmol／L ACh激活-持久缓慢的外向电流,电流幅值为（170&#177;15）pA,该电流幅值依赖于胞外钙离子浓度,可被胞外给予的钙依赖性钾通道拮抗剂TEA阻断。I型前庭毛细胞的再次激活时间不小于1min。长时间暴露在ACh的情况下,受体离子通道不会发生自发性关闭。以上结果提示,部分豚鼠I型前庭毛细胞上存在胆碱能受体,胞外给予ACh可激活-持久缓慢的外向电流,其胆碱能受体通道对于ACh的作用呈浓度依赖性和外钙依赖性、非电压依赖性或失敏性。本研究结果对于阐明前庭传出神经的功能及其作用机制,证实并揭示I型前庭毛细胞上存在传出神经递质受体以及日后临床指导眩晕疾病的康复治疗具有重要的意义。