红火蚁Toll受体家族免疫响应绿僵菌表达模式的研究

为探究红火蚁Solenopsis invicta Buren Toll受体家族基因如何免疫响应绿僵菌Metarhizium的侵染。本研究采用浸渍法测定了不同浓度下绿僵菌对红火蚁大中小3种不同大小工蚁的致病力,并用显微镜观察了绿僵菌侵染后红火蚁3种工蚁的表型变化。利用生物信息学筛选Toll受体基因,并对Toll受体家族基因的理化性质、结构域、染色体位置、系统进化进行分析鉴定。运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了红火蚁大中小型工蚁中Toll受体家族的发育历期和绿僵菌侵染后的表达模式。结果表明,绿僵菌在96 h对红火蚁大中小型工蚁的致死中浓度（LC50）分别为5.8×10^7孢子/mL、3.1×10^7孢子/mL、1.5×10^7孢子/mL;绿僵菌侵染红火蚁第3天,显微镜下观察到红火蚁体壁细小的菌丝,虫体僵硬,寄主死亡后菌丝迅速蔓延并逐渐长成橄榄绿色分生孢子;RT-qPCR结果表明Toll受体基因在红火蚁不同发育阶段中的mRNA表达水平存在显著差异,且Toll受体基因在雌性生殖蚁表达水平显著高于雄性生殖蚁;RT-qPCR结果表明红火蚁大中小型工蚁Toll受体免疫响应绿僵菌不一样。在大型工蚁中,绿僵菌侵染后,Toll受体家族基因能显著上调表达,6 h是一个诱导高峰期,Toll2-1和LRR转录水平最高,响应绿僵菌最强;在中型工蚁中,绿僵菌不能刺激Toll2-2基因的表达,却能强烈诱导Toll1,Toll2-1,Toll6,Toll7和LRR基因的上调表达,Toll1和Toll2-1响应绿僵菌最强。在小型工蚁中,绿僵菌能显著诱导Toll受体家族基因基因的上调表达,在24 h时,LRR基因表达量最高,相比于对照,LRR基因表达提高25倍,LRR在6 h和24 h响应绿僵菌最强。以上研究表明Toll受体可以免疫响应入侵的绿僵菌,且不同的Toll对绿僵菌可能具有不同的响应机制。本研究为进一步阐明Toll受体的功能奠定基础,为进一步利用绿僵菌控制红火蚁提供技术指导。     

温度对广重粉蛉生长发育和繁殖的影响

【目的】明确温度对广重粉蛉Semidalis aleyrodiformis生长发育和繁殖的影响,为天敌昆虫广重粉蛉在生物防治领域的开发和利用提供理论依据。【方法】在不同恒定温度条件下,测定广重粉蛉的发育历期和存活率,并构建实验种群生命表。【结果】随着温度的上升,广重粉蛉幼虫各阶段的发育历期逐步缩短。在26℃,成虫前期存活率最高,达85.00%,高温和低温均降低幼虫存活率;广重粉蛉成虫寿命和产卵量随温度的上升而下降,在23℃时产卵量最高（445.00粒）,且与26℃无显著差异。在26℃下,广重粉蛉实验种群的净增值力R_0、内禀增长率r_m和周限增长率λ均达到最大值。【结论】广重粉蛉对温度的适应范围在23-29℃,最佳温度为26℃,在我国南方有很好的生物防治应用前景。     

马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫SCAR标记的建立及应用

为了探索快速鉴定马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata(Motschulsky)和茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata(Fabricius)的分子生物学方法,本研究在随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)的基础上,分别设计了可以鉴别两个物种的序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)标记。从随机合成的60条引物中筛选出来2条特异性引物(分别为OPI-6和OPJ-15),引物OPI-6在马铃薯瓢虫中扩增出约750 bp的特异性条带,引物OPJ-15在茄二十八星中扩增出约750 bp的特异性条带,根据测序结果设计了两对SCAR引物对筛选结果进行验证,发现根据OPI-6的测序结果所设计的SCAR引物(OPI-6 test)仅能在马铃薯瓢虫中扩增出645 bp的条带,而根据OPJ-15的测序结果所设计的SCAR引物(OPJ-15 test)仅能在茄二十八星瓢虫中扩增出436 bp的条带。这两对SCAR引物能够准确、稳定且快速地区分马铃薯瓢虫与茄二十八星瓢虫,对这两种害虫的精准防控具有重要意义。     

广重粉蛉对烟粉虱的捕食作用研究

【目的】广重粉蛉Semidalis aleyrodiformis(Stephens)是烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)的重要天敌昆虫之一,为了明确其控制潜能,本文研究了广重粉蛉对烟粉虱的捕食作用。【方法】在室内温度(26±1)℃,相对湿度75%±5%,光照周期L∶D=14∶10条件下,对广重粉蛉幼虫捕食烟粉虱各个虫态的捕食作用进行研究。并且评估了广重粉蛉幼虫对烟粉虱卵、广重粉蛉成虫对烟粉虱若虫和伪蛹的捕食功能反应模型,同时,对广重粉蛉成虫捕食烟粉虱卵的干扰反应方程进行了拟合。【结果】广重粉蛉幼虫对烟粉虱的捕食量随着广重粉蛉龄期的增大而增大。广重粉蛉幼虫对烟粉虱卵的功能反应和广重粉蛉成虫对烟粉虱各个虫态的捕食功能反应都呈HollingⅡ型。随着广重粉蛉龄期的增加,广重粉蛉对烟粉虱卵的寻找效率(a)逐渐增加,处置时间(Th)依次缩短;而广重粉蛉成虫对不同龄期烟粉虱的功能反应是随着猎物龄期的增加,寻找效率逐渐降低,处置时间(Th)依次延长。广重粉蛉自身密度方程为E=0.127 9×P-0.317 3,干扰系数为0.317 3。【结论】研究表明,广重粉蛉4龄幼虫和雌成虫对烟粉虱有较好的捕食作用,控害潜力最大。     

蝇蛹俑小蜂卵巢发育的研究

对寄生蜂卵巢发育的研究是生理学和生物防治的重要基础。本文研究了从瓜实蝇蛹刚羽化至死亡的蝇蛹俑小蜂雌蜂的卵巢发育。结果表明蝇蛹俑小蜂内生殖系统由1对卵巢、1对侧输卵管、中输卵管、受精囊、受精囊腺等组成,羽化后卵巢迅速发育,卵巢指数从0.34 mm~2增大到0.48 mm~2,卵粒数从37.67增加到42.67。雌蜂发育4 d后,卵巢逐渐萎缩,卵巢指数、卵粒数减少。本研究得出2日龄雌蜂繁殖力最强,对评估蝇蛹俑小蜂品质和放蜂时间有潜在应用价值,使其能在生物防治过程中发挥更大的潜能。     

小菜蛾整合素integrin β1基因的克隆及其功能分析

整合素(Integrin)是一种由α和β亚基组成的跨膜异二聚体蛋白,在昆虫血细胞对外物的包囊过程中起着重要的作用。为阐明integrinβ1参与小菜蛾Plutella xylostella体内细胞免疫中的功能,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆了小菜蛾integrinβ1基因的cDNA全长序列,命名为PxIntβ1(Gen Bank登录号GQ178290)。小菜蛾PxIntβ1的cDNA全长序列为2 832 bp,开放阅读框为2 487 bp,编码828个氨基酸,成熟的氨基酸序列中有一个跨膜区和一个integrin亚基。系统进化树显示小菜蛾PxIntβ1与亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis整合素的同源性最高,两者同源性达到78%。利用半定量RT-PCR技术检测PxIntβ1基因在小菜蛾不同发育历期(卵、1-4龄幼虫、蛹、成虫)、不同组织(血细胞、体壁、脂肪体、中肠、马氏管)和细菌(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌液)诱导下的表达模式。半定量结果表明小菜蛾PxIntβ1基因在小菜蛾整个发育历期除了卵之外都有表达,4龄幼虫转录水平最高,在血细胞中特异性的高表达,混合细菌诱导2-48 h后,PxIntβ1基因在小菜蛾诱导后24 h达到诱导表达高峰。为了进一步获得重组蛋白PxIntβ1,本研究构建了原核表达质粒pET-32a-PxIntβ1,融合蛋白在大肠杆菌Eschericha coli BL21中获得高效表达,Ni-NTA一步纯化了融合蛋白,并免疫新西兰大白兔,获得了多克隆抗体anti-PxIntβ1。SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果表明,His抗体和多克隆抗体anti-PxIntβ1能特异性识别融合蛋白PxIntβ1;进一步利用显微镜观察了小菜蛾血细胞对凝胶珠Sephadex-A25的包囊情况,结果表明抗血清anti-PxIntβ1处理过的小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用受到明显抑制,重组蛋白PxIntβ1可以提高小菜蛾血细胞对Sephadex-A25凝胶珠的包囊作用;以上研究结果表明小菜蛾PxIntβ1在小菜蛾细胞免疫中起着重要的作用。     

黄龙病病菌在柑橘木虱体内的分布及感染动态

【目的】柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是传播黄龙病病菌唯一的自然媒介昆虫,本文研究了黄龙病病菌在柑橘木虱各个发育阶段体内的分布以及感染动态,为有效防控柑橘木虱提供科学数据。【方法】利用常规PCR检测柑橘木虱若虫体内的黄龙病病菌,利用q RT-PCR和荧光原位杂交技术分别检测黄龙病病菌在柑橘木虱不同发育虫态体内的含量与分布形式。【结果】常规PCR可以在3-5龄若虫以及成虫体内检测到黄龙病病菌,而q RT-PCR除了3-5龄若虫外,还可以在2龄若虫体内检测到黄龙病病菌。卵和各龄期若虫中黄龙病病菌的含量是随着龄期的变大而不断增多。产卵盛期的成虫木虱体内黄龙病病菌的含量最高,显著高于产卵前期以及产卵后期。荧光原位杂交技术可以检测到4龄、5龄若虫及成虫体内的黄龙病病菌分布形态,病菌在若虫主要分布在U型含菌体内,而在雌雄成虫体内均是散布型分布。【结论】柑橘黄龙病在柑橘木虱的2-5龄若虫及成虫中都有感染,但其含量与分布形式因发育阶段不同而有显著差异。     

柑橘木虱绿色防控技术研究进展

柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama是传播柑橘黄龙病的重要媒介昆虫,威胁我国乃至世界柑橘产业的健康发展。柑橘木虱绿色防控对保证我国生态环境和农产品质量安全,推动柑橘产业可持续发展具有重要作用。本文综述近年来以天敌、昆虫病原真菌、植物源农药为主的生物防治技术和以灯光、色板诱捕、反光膜驱避、防虫网阻隔为主的物理防治技术,在柑橘木虱绿色防控中最新的研究进展,分析其存在的问题,并对发展趋势进行了展望,为我国今后柑橘木虱科学、高效防控及其可持续治理提供参考,不断推动我国柑橘产业的持续、稳定和健康发展。     

小菜蛾PGRP-SA的体外表达及介导酚氧化酶活力的研究

肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins,PGRPs)是可以识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌的一类模式识别受体,在介导酚氧化酶级联反应中起着重要的作用。本研究以实验室克隆的小菜蛾Px PGRP-SA(Gen Bank No.EU399240)为基础,RT-PCR克隆了其开放阅读框(ORF),在原核细胞中获得了高效重组表达,利用GST一步纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备了抗血清,滴定效价为1∶51200。Western blot检测表明Micrococcus luteus和Serratia marcescens可以显著提高Px PGRP-SA在小菜蛾血淋巴中的含量。为了检测Px PGRP-SA与酚氧化酶PO的活力关系,本研究将Px PGRP-SA连接到真核表达载体p MT/Bip/V5/His A构建真核表达质粒p MTAPGRP,转染果蝇S2细胞中,获得稳定的细胞系,硫酸铜诱导获得表达后用anti-V5纯化获得重组蛋白Px PGRP-SA。将重组蛋白Px PGRP-SA与M.luteus和S.marcescens分别温育后,可以显著提高小菜蛾血浆中PO的活力。本研究结果阐明了重组蛋白Px PGRP-SA在小菜蛾体PO级联反应中的功能,为进一步研究Px PGRP-SA在小菜蛾体内免疫信号通路中的功能奠定了基础。     

六斑月瓢虫取食不同猎物的生长发育及繁殖特性

六斑月瓢虫是我国农、林、蔬、果生态系统中重要的捕食性天敌之一,能够捕食多种猎物。不同的猎物质量显著影响捕食性天敌昆虫的活力。为评价取食不同猎物对六斑月瓢虫生物学特性的影响,采用实验种群生命表的方法研究了六斑月瓢虫取食烟粉虱、豆蚜和玉米蚜的生长发育和繁殖情况。结果表明,六斑月瓢虫取食烟粉虱的世代发育历期最长、存活率、雌虫寿命和繁殖力最低,分别为(26.15±0.42)d、(52.95±1.98)%、(53.73±2.17)d和(157.67±16.79)粒/雌;而取食玉米蚜的世代发育历期最短、存活率、雌虫寿命和繁殖力最高,分别为(16.40±0.49)d、(77.93±0.76)%、(68.33±4.31)d和(798.77±44.29)粒/雌;取食豆蚜时的各生物学参数介于两者之间。种群生命表参数也反映了类似的结果,取食烟粉虱的净增殖率(R0)、内禀增长率(r_m)和周限增长率(λ)最低分别为71.216、0.092和1.094,世代平均历期(T)最长为47.377d;取食玉米蚜的R_0、r_m和λ最高分别为290.281、0.131和1.143,T最短为42.428d。总体来看,相对于烟粉虱而言,蚜虫更适合六斑月瓢虫的生长发育和繁殖,且玉米蚜优于豆蚜。