奥利亚罗非鱼EF-1α基因的克隆与结构分析

真核生物延伸生长因子基因(EF-1α)在蛋白质翻译过程中起着重要的作用,其序列具有高度的保守性,是一种管家基因.本文通过 RT-PCR 克隆出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)EF-1α的部分cDNA序列,其长度为425 bp,翻译成141个氨基酸,计算的蛋白质分子量为15.1 ku.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼EF-1α氨基酸序列与尼罗罗非鱼(O.niloticus)的相似性最高,为100%;与青鳉(Oryzias latipes)、欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)、鲑鱼(Salmo trutta)的相似性分别为92%、91%、85%、82%;与小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)、鸡(Gallus gallus)的相似性均为85%.同时克隆出奥利亚罗非鱼EF-1α相应的DNA序列,共506 bp.cDNA与DNA的序列比对显示克隆出的奥利亚罗非鱼EF-1α含有1个内含子,这为将来设计EF-1α荧光定量引物以及测定其在不同组织中的表达量变化打下基础.     

奥利亚罗非鱼DMO和DMT蛋白二级结构和B细胞抗原表位的预测

以DMO和DMT氨基酸序列为基础,采用Garnier-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测蛋白质的二级结构;按Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法预测DMO和DMT蛋白的B细胞抗原表位。预测结果表明：在DMO蛋白N-端第80～112,144～147,193～194,251～255,260～269区段和279～283区段,DMT蛋白N－端61～86,98～105,140～146,239～241区段和第269～273区段,可能是α-螺旋中心;DMO蛋白N-端第59～61,69～70,148～150区段和383～390区段,DMT蛋白的N-端第125～129,207～213,255～264区段和第281～284区段,可能是β-折叠中心;在DMO蛋白分子N-端40～41, 44～45,50～51,128～129,189～192,204～207,216～222,226～233,244～246,298～299区段和第323～326区段和DMT蛋白分子N-端第12～13,26～27,43～44,58～60,93～95,115～120,136～139区段和第149～151区段具有较柔软的结构,这些区段有可能进行一定幅度的摆动或折叠而形成较复杂的三级结构。DMO蛋白N-端第1～5,41～51,65～67,86～89,98～110,154～170,183～203,205～248,258～264,284～291,293～298,270～375,389～392,402～410区域和DMT蛋白N-端第1～9,17～28,77～84,114～123,131～139,157～184,196～207区域可能是B细胞表位优势区域。以蛋白质的二级结构预测作为辅助手段,用抗原指数,亲水性参数和可及性参数预测DMO和DMT蛋白的B细胞表位,为DMO和DMT蛋白单克隆抗体的制备提供了线索,为系统研究奥利亚罗非鱼DMO和DMT基因的性别调控机理研究提供参考。     

建鲤和荷包红鲤肌肉脂肪、脂肪酸组成以及Apo-C-I转录水平的比较

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建鲤肠型脂肪酸结合蛋白基因的分离及其SNPs与增重的相关分析

文章采用PCR方法从建鲤 (Cyprinus carpio var. jian) 基因组分离到2个肠型脂肪酸结合蛋白基因 (Fatty acid binding protein 2, FABP2), ORF长度均为399 bp, 相似度为92.2%, 分别记为jlFABP2a、jlFABP2b, 和斑马鱼 (Danio rerio) FABP2 ORF的相似度分别为88.0%和90.5%。jlFABP2s基因结构与FABPs家族其他成员一致, 由4个外显子和3个内含子组成, 2a和2b间内含子序列和长度差异明显。系统树显示这2个基因对应斑马鱼的1个FABP2基因, 和鲤鱼染色体数是斑马鱼的2倍一致。实时荧光定量PCR结果显示, jlFABP2a、2b在建鲤肠中的表达量极显著高于脑、肝脏、肌肉、肾脏、心脏、性腺等其他组织 (P<0.01), 且2a表达量显著 (雄鱼, P<0.05) 或极显著 (雌鱼, P<0.01) 高于2b, 但在其他组织则2b表达量稍高, 暗示2a为肠特异性表达, 2b则为广谱表达。通过比对8尾建鲤的2a和2b基因序列, 在2a和2b上分别找到12个和4个SNP, 均位于内含子上。使用PCR-RFLP 法检测jlFABP2a 上4个SNP 位点I1-A15G、I1-A99G、I2-C487T和I3-A27T在建鲤选育群体中的基因型分布, 并进行了基因型与个体增重的关联分析, 结果表明, 4个位点与雌、雄成鱼阶段增重分别有极显著或显著相关。同时考虑4个位点的基因型与增重的关系, 结果基因型AGGGCCXX 和AGGGXXAT的个体平均增重比其他个体快15%, 这两种基因型个体在选育群中占了9%, 具有较大的选育空间, 可用于建鲤分子育种计划中。     

建鲤leptin两种原核表达载体的构建和表达

使用SignalP-4.0软件预测信号肽剪切位点,设计引物扩增建鲤(Cyprinus carpio var.jian)leptin基因(jlLEP-A1,jlLEP-B)不含信号肽的ORF区域。扩增产物分别连接到pET-32a(+)和pGex-4T-1原核表达载体,构建重组质粒,测序验证插入位点的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白pET-32a(+)/jlLEP-A1,pET-32a(+)/jlLEP-B和pGex-4T-1/jlLEP-A1,pGex-4T-1/jlLEP-B。结果表明,在37℃和1 mmol/L IPTG的条件下诱导5 h,重组蛋白表达量最大。SDS-PAGE电泳显示重组蛋白主要以可溶蛋白形式存在。这一结果为后续的建鲤leptin基因功能研究奠定了基础。