与猪流行性腹泻病毒M蛋白互作的宿主蛋白的鉴定

【背景】猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)膜蛋白(M)在病毒粒子的组装、膜融合和病毒复制等方面具有重要的作用,但M蛋白与宿主细胞的互作机制尚不清楚。【目的】利用免疫沉淀技术和液质联用技术筛选细胞内与PEDVM蛋白相互作用的蛋白,为揭示M蛋白在病毒增殖过程中发挥的功能提供研究基础。【方法】将MOI=0.1的PEDV DR13疫苗株接种于长成单层的Vero细胞,感染36 h后,收集细胞并进行裂解。利用抗M的单克隆抗体沉淀与M相互作用蛋白复合物,通过液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行鉴定并利用细胞功能富集分析(Gene ontology,GO)对感染组鉴定到的细胞蛋白进行分析,确定两个细胞内源性蛋白为候选蛋白,进行免疫共沉淀(Co-IP)验证和共定位分析。【结果】基于鉴定蛋白的肽段数的方法分析显示,感染组与对照组相比,鉴定了218个与M蛋白相互作用的细胞内源性蛋白,分别与蛋白质合成、代谢、细胞信号通路转导等密切相关,选择细胞分裂周期蛋白42 (Cell division cycle 42,CDC42)、真核翻译起始因子3亚基L蛋白(eIF3L)为候选蛋白进行Co-IP(Co-immunoprecipitation)验证和共定位分析,结果证实CDC42、eIF3L蛋白分别与M蛋白在细胞内存在相互作用。【结论】鉴定出PEDV M蛋白能够与宿主细胞CDC42和eIF3L蛋白相互作用,并鉴定出其他可能与M蛋白发生相互作用的宿主蛋白60个,为开展PEDV与宿主细胞蛋白相互作用研究提供了重要理论依据。     

牛传染性鼻气管炎可视化LAMP检测方法的建立和应用

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守序列(GenBank Accession No. DQ006857.1),利用Primer ExplorerV4软件设计3对LAMP引物,通过反应体系的优化、敏感性试验和特异性试验,建立IBRV的LAMP检测方法,并对393份临床样本进行了检测应用。结果显示,建立的IBRV LAMP方法在65℃、50 min条件下可扩增出LAMP特征性梯状条带,并可通过颜色变化判定结果。该方法可以检测到10copies/μL的质粒DNA,与nested-PCR方法的敏感性相当,比PCR方法敏感1000倍,且与牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒、水泡口炎病毒等均无交叉反应。应用该方法检测301份鼻腔拭子和92份血清样本,阳性率分别为87.6%和58.8%,表明鼻腔棉拭子更适用于IBRV的临床检测。文中建立的IBRV LAMP方法具有可视化、快速、特异、灵敏性强的优势,适合基层和现场对临床样本进行快速检测,为IBR的防控提供了技术支撑。     

重组毕赤酵母产猪IFNα的诱导条件

采用Plackett-Burman实验设计,选取甲醇、酵母粉、蛋白胨、K2HPO4.12H2O、MgSO4、(NH4)2SO4、pH和PTM1这8个对重组猪IFNα表达量有影响的相关因子进行筛选,用SAS软件进行统计分析,分析表明:甲醇、蛋白胨以及K2HPO4.12H2O对重组猪IFNα表达量具有显著性影响;之后采用Box-Behnken设计及响应面分析法确定最佳的诱导条件。在最优条件下,重组猪IFNα表达量比优化前提高了2.46倍。     

B细胞表位作图研究进展

抗原-抗体的特异性结合是由抗体表面的抗原决定簇与抗原表面的表位基序间的特异性互补识别决定的。B细胞表位作图既包括B细胞抗原表位基序的鉴定(即确定抗原分子上被B细胞表面受体或抗体特异性识别并结合的氨基酸基序),也包括绘制抗原蛋白的全部或接近全部的B细胞表位基序在其一级或高级结构上的分布图谱的过程。B细胞表位作图是研发表位疫苗、治疗性表位抗体药物和建立疾病免疫诊断方法的重要前提。目前,已经建立了多种B细胞表位鉴定或绘制抗原蛋白B细胞表位图谱的实验方法。基于抗原-单抗复合物晶体结构的X-射线晶体学分析的B细胞表位作图和基于抗原蛋白或抗原片段的突变体库筛选技术的B细胞表位作图可以在氨基酸水平,甚至原子水平上揭示抗原分子上与单抗特异性结合的关键基序;其它B细胞表位作图方法(如基于ELISA的肽库筛选技术)常常只能获得包含B细胞表位的抗原性肽段,因而,很少用于最小表位基序的鉴定;而改良的生物合成肽法多用于B细胞表位的最小基序鉴定和精细作图。鉴于每种B细胞作图方法都存在各自的优势与不足,B细胞表位作图往往需要多种作图方法的有机结合。本文对目前常用的B细胞表位作图的实验方法及其在动物疫病防控中的应用进行综述,以期为研究者设计最佳的表位作图方案提供参考。     

甲醇／山梨醇共混诱导改善重组毕赤酵母表达猪a干扰素发酵过程和NADH再生效率

在10L发酵罐中利用重组毕赤酵母诱导表达猪a干扰素（pIFN-a）,考察甲醇／山梨醇共混诱导策略对pIFN-a表达水平提高和能量（NADH）再生效率的影响。结果表明：在诱导稳定期,甲醇／山梨醇共混诱导可弱化细胞的甲醇代谢,有利于缓解毒副中间产物（过氧化氢、甲醛等）的生成积累;以0．785g／（L·h）的速率缓慢共混流加山梨醇时,pIFN-a抗病毒活性最大,最高活性可达1．8×107IU／mL,与30℃常温甲醇单独诱导（最高活性1．0X10。IU／mL）和20℃低温甲醇单独诱导（最高活性1．4×lO6IU／mL）相比,活性均大幅提高,且胞外pIFN-a的降解减缓;发酵体系的抗高甲醇浓度冲击能力有效提高,发酵生产的稳定性增强;能量利用效率大幅提高,NADH的再生利用效率提高了29％-84％。     

雏番鸭细小病毒vp3基因的原核表达及增殖病毒的检测

近年来,番鸭细小病毒出现新的流行趋势,估计与病毒基因变异有关,因此针对新流行毒株研发新的检测方法很有必要。本研究根据番鸭细小病毒(MDPV)2012年分离株SAAS-SHNH的全基因序列,设计了一对特异性引物,利用PCR技术扩增全长vp3基因,经鉴定正确后,进行同源性比对分析,同时将其克隆到PET28a载体,构建成PET28a-VP3原核表达载体,经转化及IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳和Western blotting分析,表达出与预期大小相符的63.1 k Da的蛋白,该蛋白可与临床采集的免疫过MDPV的番鸭血清结合,说明该蛋白可用于MDPV的血清学检测。将纯化后蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔源MDPV-VP3蛋白的多克隆抗体,制备的兔源血清能够与MDPV疫苗弱毒株及J3D6株VP3蛋白发生特异结合;MDPV感染原代鸭胚成纤维细胞(DEF)后,利用兔源血清作为一抗进行免疫荧光分析(IFA)分析,在DEF细胞核和细胞质内均能检测到VP3蛋白,表明利用VP3蛋白制备的抗血清可以用于MDPV免疫荧光分析细胞增殖病毒的检测。这为今后MDPV的快速检测提供了技术基础。     

基因工程猪生长激素的分离提纯及变复性技术的研究

生长激素 (Ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｍｏｎｅ ;Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ)调节动物的生长及其体内多种代谢过程。文献报道使用猪生长激素 (ＰＧＨ)可显著加快猪生长速度 ,提高胴体瘦肉率和饲料报酬[1 ] 。因为ＰＧＨ潜在的巨大经济价值 ,国内外一些科研机构都研究采用基因工程的方法实现产业化生产。这些研究几乎都是采用原核表达系统 ,产物都是形成包含体[2 ,3] 。但在包含体的分离提取及变复性的方法上差别极大。 1987年ＫｅｉｔｈＥ .Ｌａｎｇｌｅｙ在做蛋白复性时创新性地采用了包含体蛋白在高浓度的变性剂溶液中直接氧化复性的方法 ,此方法…     

猪流行性腹泻病毒反向遗传操作技术及其应用

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪(特别是新生仔猪)急性、高度传染性消化道疾病的主要病原之一;2010年底以来,猪流行性腹泻(PED)的再次暴发给我国乃至全球养猪业造成了巨大经济损失。最近,研究者已先后建立了基于靶向RNA重组技术、细菌人工染色体(BAC)载体系统和体外连接技术的PEDV反向遗传学操作技术,为PEDV编码的蛋白质的功能、致病机制以及新型疫苗的研发开辟了新的思路。本文对PEDV反向遗传操作技术的研究进展及其在PEDV胰酶依赖性、S蛋白和ORF3蛋白的功能以及新一代疫苗研制等方面的应用现状进行了综述与展望。     

猪IFNα基因在毕赤酵母中的高效分泌表达

巴斯德毕赤酵母载体质粒pPICZαA含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列,构建猪IFNα基因的重组质粒pPICZαA-IFNα,并转入E.coli JM109中,得到转猪IFNα基因工程菌,经酶切鉴定克隆到载体pPICZαA上的外源基因即为猪IFNα基因。通过电击将经SacⅠ酶切后线性化的pPICZαA-IFNα质粒转化到巴斯德毕赤酵母KM71中。SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的结果表明,分泌于胞外的猪IFNα蛋白分子量比猪IFNα理论值分子量稍大,估计是糖基化的原因。表达的蛋白可发生正确的抗原-抗体反应,表达量为 0.45 mg/mL。将蛋白表达上清经细胞毒性实验检测表达产物的抗病毒活性为2.1×104 IU/mL。Abstract: The porcine alpha interferon gene was inserted into the Pichia pastoris expression vector of pPICZαA which contains AOXⅠpromoter and α-factor signal sequence.The recombinant plasmid was transformed into host cell E.coli JM109 and then was extracted for analysis of restriction enzymes.It was confirmed that heterogeneous gene spliced into vector pPICZαA was IFNα gene. The recombinant plasmid of pPICZαA-IFNα was linearnized by SacⅠand transformed into KM71 by electroporation. SDS-PAGE and Western blot analysis showed that IFNα product was observed in the supernants with a little larger molecular weight size than the natural IFNα.The rIFN gene has the same antigenicity as natural one.The expressed rIFN accumulated up to about 0.45mg/mL.The cytokine activity of the supernants was vertified by WISH/VSV system,which is about 2.1×104IU/mL.