16S/18S/ITS扩增子高通量测序引物的生物信息学评估和改进

【背景】在过去的十几年里,基于核糖体RNA基因的扩增子测序技术被广泛用于各种生态系统中微生物群落的多样性检测。扩增子测序的使用极大地促进了土壤、水体、空气等环境中微生物生态的相关研究。【目的】随着高通量测序技术的不断发展和参考数据库的不断更新,针对不同的环境样本的引物选择和改进仍然需要更深入的校验。【方法】本文收集了目前在微生物群落研究中被广泛采用的标记基因扩增通用引物,包括16S rRNA基因扩增常用的8对通用引物和2对古菌引物、9对真菌转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)基因扩增引物,以及18S rRNA基因扩增的4对真核微生物通用引物和1对真菌特异性引物。这些引物中包括了地球微生物组计划(Earth Microbiome Project,EMP)推荐的2对16S rRNA基因扩增引物、1对ITS1基因扩增引物和1对18S rRNA基因扩增引物。采用最近更新的标准数据库对这些引物进行了覆盖度和特异性评价。【结果】EMP推荐的引物依然具有较高的覆盖度,而其他引物在覆盖度及对特定环境或类群的特异性上也各有特点。此外,最近有研究对这些通用引物进行了一些改进,而我们也发现,一个碱基的变化都可能会导致评价结果或扩增产物发生明显变化,简并碱基的引入既可以覆盖更多的物种,但同时也会在一定程度上降低关注物种的特异性。【结论】研究结果为微生态研究中标记基因的引物选择提供了一个广泛的指导,但在关注具体科学问题时,引物的选择仍需数据指导与实验尝试。     

高通量测序分析重庆地区茅苍术根际丛枝菌根真菌多样性

【背景】丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是土壤微生物区系中分布最广泛的一类菌根真菌,能与地球上90%的维管植物形成共生体,可通过调节植物的生理代谢过程增强植物的抗逆性。【目的】揭示重庆地区中药材茅苍术根际土壤中AMF的结构与组成,解析土壤因子对AMF类群的影响。【方法】以重庆地区茅苍术主产地彭水县、秀山县、石柱县、南川区和酉阳县2-3年生茅苍术根际土壤为材料,利用Illumina MiSeq 2500测序平台进行真菌扩增子测序,分析不同地点土壤的茅苍术根际AMF类群组成和多样性的差异。【结果】茅苍术的菌根侵染率均在50%以上,每10g风干土壤中孢子含量在50个以上,最高达到144个。根际土壤共检测到球囊菌门Glomeromycota的3纲4目8科9属AMF,包括Glomus、Claroideoglomus、Gigaspora、Paraglomus、Archaeospora、Ambispora、Acaulospora、Diversispora和Scutellospora,其中前6属为5个区县土样共有。球囊霉属(Glomus)相对丰度最高,达67%,为所有地区茅苍术根际样本中的优势类群。冗余度分析(redundancy analysis,RDA)表明,土壤pH对AMF群落组成影响最大。pH、有机质、碱解氮、速效钾与Shannon指数呈正相关,有效磷与之呈负相关;各土壤因子与Simpson指数的相关性则相反。5个土壤因子均与丰度(Chao1)指数呈负相关。另外,pH、有机质与均匀度(ACE)指数呈正相关;碱解氮、速效钾、有效磷与之呈负相关。【结论】茅苍术根际土壤中AMF资源丰富,土壤因子对AMF群落组成和丰度影响显著,是导致AMF群落结构地理分布格局差异的重要原因之一。     

黑果枸杞不同组织内生细菌群落多样性

【目的】黑果枸杞是我国荒漠区特有的药用盐生植物,本研究分析了黑果枸杞不同组织中内生细菌群落多样性特征及分布规律。【方法】应用Illumina MiSeq高通量测序技术对黑果枸杞内生细菌的16S rRNAV5-V7区域序列进行测定,并分析群落组成、多样性及功能等生物学信息。【结果】黑果枸杞不同组织内生细菌群落多样性及功能均有较大的差异。花、叶、果、茎和根产生的OTUs分别是182、173、119、187和254,群落多样性表现为根花果、茎叶。从门水平上看,变形菌门是优势菌门,在不同组织中均有分布,花、叶、果、茎和根中的相对丰度分别为87.66%、41.51%、81.76%、97.67%和61.85%。在属水平上显示内生细菌的分布表现出器官差异性。花部能够准确分类的优势菌属为沙雷氏菌属和不动杆菌属,相对丰度分别为11.57%和8.55%。叶部为红球菌属和慢生根瘤菌属,相对丰度分别为29.68%和5.53%。果实中为泛菌属、红球菌属和沙雷氏菌属,相对丰度分别为23.12%、5.52%和4.29%。茎部为沙雷氏菌属和假单胞菌属,相对丰度分别为12.03%和17.71%。根部为盐单胞菌属、Fodinicurvata和Lipingzhangella,相对丰度分别为24.18%、5.16%和4.86%。在不同组织中分布较广的盐单胞菌、沙雷氏菌、不动杆菌、红球菌、泛菌等菌属均具有较高耐盐性和促生、生防、降解有机污染物及抗氧化等功能。PICRUSt功能预测分析显示,黑果枸杞组织中内生细菌功能中涉及丰富的多糖、萜类和酮类、酶及维他命等次生代谢产物的生物合成。【结论】黑果枸杞内生细菌具有丰富的群落和功能多样性,拥有多种益生功能性状,也含有多个与人和植物体代谢相关的功能信息。不同组织优势菌属和功能信息各有不同,其中根部的内生细菌物种最丰富,花部和茎部参与各种代谢调控的细菌丰度最高。此外,不同组织中还含有大量未知种属的微生物类群,这些都为内生细菌功能利用和挖掘新的有益微生物资源提供广阔的发展空间。     

不同生境草鱼肠道微生物组成和群落特征分析

【目的】分析不同生境来源的草鱼前肠、中肠和后肠的微生物组成和群落特征。【方法】利用16S rRNA高通量测序技术比较河流、湖泊、高密度池塘养殖与水库低密度养殖4种不同生境来源的草鱼其前、中、后肠的微生物组成和群落特征。【结果】Venn图、稀释性曲线和Alpha指数分析结果显示,前肠微生物群落多样性以养殖生境草鱼更高,而后肠微生物群落多样性以自然生境草鱼更高。不同生境草鱼前肠微生物组成和群落特征差异较大,自然生境的草鱼前肠微生物优势菌群都是不动杆菌属和贪铜菌属;高密度池塘养殖生境优势菌群是鲸杆菌属、希瓦氏菌属;低密度水库养殖生境的草鱼前肠优势菌群是链球菌属、消化链球菌属等。【结论】不同生境的环境因子不同,养殖方式不同,饵料不同,导致草鱼前肠微生物组成和群落特征的差异较大,该结果可为草鱼肠道微生物的研究提供基础数据。高密度养殖生境的草鱼存在潜在的感染风险,建议优化养殖模式以减少有害菌的产生。     

大熊猫精液和包皮菌群组成及潜在致病菌调查

[目的] 大熊猫是我国国家一级保护动物,其种群面临着传染病和栖息地破碎化等持续威胁,其中生殖系统的细菌感染和菌群失衡会影响大熊猫生殖健康,严重者可导致流产,是引起大熊猫繁殖障碍的原因之一。本研究对精液与包皮分泌物样本的菌群组成情况及分离培养潜在致病菌开展研究。[方法] 通过采集13份大熊猫包皮分泌物和12份精液样本,采用16S rRNA扩增子测序技术、细菌培养及PCR鉴定的方法,确定样本中的细菌种类。[结果] 菌群组成分析结果显示,在门水平上,厚壁菌门（Firmicutes）的细菌丰度在大熊猫包皮与精液中均为最高;在属水平上,不同时期的雄性大熊猫包皮的菌群可能会发生改变,棒状杆菌属（Corynebacterium）和Dolosicoccus是Ⅰ期包皮样本中最丰富的微生物菌群,相对丰度分别为15.45%和12.40%;链球菌属（Streptococcus）和埃希氏菌属（Escherichia）是Ⅱ期包皮样本中最丰富的微生物菌群,相对分度分别为37.94%和9.68%;拟杆菌属（Bacteroides）和普雷沃氏菌属（Prevotella）是精液样本中最丰富的微生物菌群,相对丰度分别为14.40%和12.88%。菌群多样性分析结果显示,精液样品高于Ⅰ期包皮样品和Ⅱ期包皮样品,Ⅰ期包皮样品和Ⅱ期包皮样品之间无显著差异。通过细菌分离培养得到肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）在内的多种潜在性致病菌。[结论] 本研究分析了大熊猫精液和不同时期包皮分泌物的菌群组成,其优势菌属存在差异,大熊猫包皮与精液中存在潜在性致病菌,这可能对大熊猫的生殖系统健康带来威胁,其致病性有待进一步研究。     

DPSN：扩增子测序引物标准化命名数据库

扩增子测序是目前用来衡量微生物多样性时使用最广泛的测序手段。因为其扩增的需要,所以选择合适的特定引物是必需的,且其对结果影响甚大。probeBase是目前最常用的记录了人工校正后的rRNA探针和引物的数据库。然而,我们发现probeBase中63.58%的引物存在不同程度的注释错误,包括命名重复、命名无规律以及匹配位置错误等。更严重的是,目前主流的短命名方式不具有唯一性,导致对应关系模糊不清。因此,我们定义了更简单可行的短命名标准并开发了新的引物科学命名数据库（DPSN）,并对probeBase里的所有173个引物进行了校正,并新加入了4个新的改良引物以及38个针对大亚基的新引物。新的短命名规则包含3个基本要素：在正链5''端的位置、版本号和方向。此外在前面加入了识别大/小亚基以及主要针对的菌界的标志。使用DPSN,可以快速查找感兴趣区域对应的引物并比较不同版本的差异选择合适的引物。同时还能建立命名与序列的明确一一对应关系,避免歧义。     

云杉腐烂病菌Cytospora piceae全基因组测序及比较基因组分析

【目的】壳囊孢属(Cytospora)真菌引起的林木腐烂病和枝枯病,是一类重要的、分布广泛的枝干病害,可引起重大经济损失和生态破坏。通过全基因组测序和比较基因组学分析,探究不同腐烂病菌的全基因组特征,分析其与寄主选择和致病性相关的基因或基因家族的差异性,将有助于进一步揭示腐烂病菌与寄主互作的分子机制,为腐烂病的有效防治提供基础资料。【方法】采用PacBio测序技术对云杉腐烂病菌Cytosporapiceae进行了全基因组测序和组装,并通过比较基因组学方法,从基因组水平探究引起腐烂病的4种腐烂病菌的基因组的差异,分析其共有的和特有的与致病相关的基因家族。【结果】C. piceae基因组大小为39.25 Mb,GC含量为51.79%。基于单拷贝直系同源基因构建的系统发育树显示,C. piceae与Cytospora chrysosperma的进化关系相近,Valsamali和Valsapyri则更相近。比较基因组学分析表明,4种腐烂病菌均具有重复诱导的点突变(RIP)活性,其中,C. piceae的RIP活性最强。与其他3种腐烂病菌相似,与木质素降解相关的AA3和AA7家族在C. piceae中显著扩张,但木质素降解关键酶AA5家族均缺失;C. piceae和C. chrysosperma基因组中果胶降解关键酶GH28和CE8家族基因的数量与V. mali和V. pyri相近。4种腐烂病菌都含有较多数量的MFS(major facilitator superfamily)超家族转运蛋白和较少的ABC(ATP-binding cassette transporter)超家族转运蛋白,但C. piceae含有更多DHA2、PDR和MDR类转运蛋白。4种腐烂病菌的分泌蛋白的GO分类分子功能主要集中在水解酶活性,其中V. mali含有最多数量的该类别基因;而生物学过程则集中在碳水化合物代谢过程、果胶分解过程和氧化还原过程。在次生代谢核心基因中,C.piceae的PKS基因明显少于V.mali和V.pyri;在C.piceae含有的4个特异性次生代谢基因中,3个为NRPS基因。【结论】4种腐烂病菌含有的碳水化合物活性酶的种类和数量相似,且都具有较强的果胶降解能力。不同腐烂病菌的膜转运蛋白中多药转运体的选择性扩增,以及次生代谢核心基因中NRPS类基因的特异性存在和缺失,表明它们作为重要的致病因子很可能在腐烂病菌寄主选择中发挥了重要的作用。     

贵阳地区蝉花微生态系统中细菌种群结构与功能

【目的】探索自然生态下蝉花内菌核、菌膜和环境细菌群落结构、功能及其相互关系。【方法】对细菌16S rRNA扩增片段进行高通量测序,分析贵阳市大将山和贵阳森林公园的蝉花内菌核、菌膜及其生境土壤的细菌群落组成、多样性及潜在功能。【结果】蝉花内菌核样本共检测到细菌562个属,菌膜样本521个属,菌际土样本578个属。两地的各组样本细菌群落结构相似,内菌核样本中假单胞菌属Pseudomonas、沙雷氏菌属Serratia占优势地位;菌膜样本中假单胞菌属和氨基杆菌属Aminobacter占优势;土壤样本以未分类的酸杆菌纲Acidobacteria和黄杆菌科Xanthobacteraceae为优势属。Venn图分析显示,菌际土样本包括了菌膜样本的大多数属,内菌核样本拥有较多的特有属,如沃尔巴克氏体属Wolbachia和立克次氏体Rickettsia等。PICRUSt功能预测结果显示,共计24个基因功能家族,主要与物质能量的代谢运输、细胞的行为发生及调控等功能相关。【结论】蝉花及其微生境中细菌具有丰富多样性,它们的潜在功能可能与营养物质的新陈代谢有关,对蝉花的个体生长发育有重要作用。研究结果对蝉花虫草的生态信息数据补充和仿野生栽培具有参考价值。     

紫花针茅根际和体内真菌群落结构及与土壤环境因子的相关性研究

[目的] 探究青藏高原不同地区高寒草原紫花针茅根际和体内真菌群落的组成、多样性等特征,及与土壤环境因子（理化性质和酶活性）间的相互关系。[方法] 从青藏高原不同地区采集紫花针茅样品,应用土壤化学方法分析根际土壤理化性质和酶活性,并采用Illumina Miseq高通量测序技术,解析根际土壤和体内真菌群落组成和丰度、Alpha多样性和菌群结构,同时分析了紫花针茅根际真菌种群多样性与土壤环境因子的相关性,厘清了影响紫花针茅根际真菌区系的土壤环境因素。[结果] 三个采样地的根际土壤呈中性偏碱,土壤理化性质和酶活性变化各异。高通量测序共得到314801条有效序列和4491个OTUs;XZ样地的紫花针茅真菌多样性和丰富度相对偏低,GS样地最高。在门分类水平上,子囊菌门Ascomycota和担子菌门Basidiomycota是主要内生真菌类群,占总菌群的88.28%。不同采样地区紫花针茅体内真菌群落结构存在明显差异,而根际土壤真菌群落结构差异不大。相关性分析表明,紫花针茅真菌多样性与土壤pH、有效钾、铁、钙、镁、多酚氧化酶、过氧化物酶和脱氢酶呈显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）正相关,而与海拔、土壤酸性磷酸酶呈极显著负相关。RDA分析发现,紫花针茅根际土壤真菌不同,影响的土壤环境因子也不同。[结论] 青藏高原高寒草地紫花针茅根际和体内栖息着丰富的真菌群落,其组成和多样性受多种土壤环境因子影响,且影响不同真菌群落的主要土壤环境因子也不同。本研究对于有益微生物资源的开发、利用及保护具有重要意义,并为紫花针茅草原保育和合理开发利用提供科学依据。