恒河猴Mamu-A^＊01基因与SIV／SHIV感染相关的研究进展

SIV／SHIV感染的恒河猴是研究艾滋病及艾滋病药物筛选、疫苗评价较理想的动物模型。MHC在细胞免疫中起着关键作用,研究表明,MHC-I类分子的多态性与SIV／SHIV感染者的疾病进展有着明显的关联作用,Mamu-A^＊01是恒河猴中的一种MHC-I类分子,它可以呈递特定的病毒蛋白片段到细胞的表面,从而激发CTL反应。国外发现Mamu-A^＊01阳性的猴艾滋病恒河猴会出现疾病进展缓慢,存活时间长等特征。本文就恒河猴Mamu-A^＊01基因与SIV／SHIV感染相关的研究进展做一综述,以期进一步加深对MHC在疫苗研究中的作用的了解,并促进更行之有效地对HIV／AIDS疫苗进行评价。     

靶向融合蛋白XE-TNFαm2激活并清除潜伏于受感染细胞内的HIV的研

制备了工程化靶向融合蛋白XE-TNFαm2。其中,XE为HIV/SIV辅助受体CXCR4的第二胞外域。TNFαm2是经突变改型的TNFα,其毒副作用已降低18倍,己用于临床治疗恶性肿瘤。本研究所用的整合有HIV的标准细胞株J-Lat Tat-GFP(H2/9855),为美国NIH艾滋病试剂中心所赠送。其中,一个经缺失突变后的HIV被整合在Jurkat细胞的染色体上,成为5’LTR-Tat-GFP-3’LTR。不同剂量的XE-TNFαm2加于一定量的JurkatH2/9855细胞后,流式细胞仪检测结果表明,荧光蛋白的表达量随着处理时间的延续而增加,并有XE-TNFαm2剂量的依赖关系。这一结果表明,XE-TNFαm2可强力激活潜伏于细胞染色体中的HIV,使之重新繁殖起来。鉴于己有的研究表明,XE-TNFαm2可杀灭受HIV/SIV感染的细胞。据此,当重新繁殖的HIV开始出芽时,其gp120必然出现在宿主细胞表面,且此gp120必然被XE-TNFαm2中的XE所结合,并其TNFαm2的杀伤信号将转导进入细胞。这样,这些宿主细胞将被杀灭。细胞的死亡导致未成熟HIV繁殖的中止。最后,在重新繁殖且成熟起来的HIV导致细胞破碎并释放出细胞之前,细胞内尚无感染力的未成熟HIV将同死亡的宿主细胞一起被清除。     

NK细胞与HIV/SIV感染相关性的研究进展

NK细胞作为天然免疫系统的重要组成部分,其在HIV/SIV感染后的免疫机制及如何发挥抗病毒作用成为近几年艾滋病研究的热点之一。研究中发现,伴随HIV/SIV的感染,NK细胞亚群比例发生改变同时伴有功能缺陷,这种变化与HIV/SIV慢性感染阶段病毒复制水平有显著相关性。并且由于归巢受体表达的改变引起NK细胞在HIV/SIV感染者体内不同组织间的重新分布。NK细胞表面的受体KIR3DL1和KIR3DS也表现出对HIV感染的抵抗作用。这些发现为我们进一步研究NK细胞的抗HIV/SIV病毒感染的免疫机制提供了新的思路和方向。     

SIVmac239感染恒河猴急性期回肠派氏淋巴结中淋巴细胞亚群的变化

目的分析SIVmac239感染早期中国恒河猴回肠派氏淋巴结淋巴细胞数量及亚群的变化,探讨这些变化与疾病进展的可能关系。方法以静脉注射SIVmac239制备恒河猴AIDS模型,对回肠派氏淋巴结进行CD4和CD8免疫组化标记,分离Peyer’s集合淋巴结淋巴细胞,分别标记CD3、CD4、CD8、CD28、CD95单克隆抗体,以流式细胞仪检测T细胞及其亚群的表达情况。结果 SIVmac239感染急性期中国恒河猴Peyer淋巴结中CD4＋/CD8＋比值持续下降,记忆性细胞比例升高,但Peyer淋巴结形态及CD4＋T细胞数量未见明显变化,CD8＋T细胞从第5天开始持续升高。结论 SIVmac239感染急性期,中国恒河猴回肠派氏淋巴结形态及CD4＋T细胞数量基本维持,向记忆性细胞的转化增加,但是CD4＋/CD8＋比值下降。     

表现神经症状的SIVmac251感染猴大脑基底节病毒gp120序列变异分析

目的 研究猴免疫缺陷病毒SIVmac251在中国恒河猴感染传代过程中产生的可能的神经侵袭性和神经嗜性及其分子机制.方法 从静脉感染SIVmac251-155p6N的8只实验猴中出现严重神经症状的1只猴中,监测病毒及免疫指标变化,观察临床症状、猴脑组织病变,单拷贝PCR扩增病毒gp120序列并分析变异及糖基化位点变化情况.结果 感染猴晚期出现明显艾滋病脑病症状,病理切片显示脑组织出现多核巨细胞及神经元变性、坏死.脑基底节分离出单一序列病毒,其氨基酸序列与血浆病毒及感染毒株SlVmac251-155p6序列差异主要位于Gp120的V1和V4区,并且在C1区66位出现一个糖基化位点缺失.结论 SIVmac251在猴体长期传代过程中表现出神经嗜性毒株的特征,对AIDS脑病研究具有重要意义.     

实时荧光定量PCR的研究进展及应用

实时定量PCR(real-time PCR)的应用范围非常广泛,包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。由于传统的PCR技术不能准确定量,使其在实际应用方面受到很大限制,因此,对PCR产物进行准确定量,尤其是病毒性病原的动态监控,成为迫切需要。     

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.方法 巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经限制性内切酶Not I酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL.结论 制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数.     

BALB/C等乳鼠流行性腹泻(EDIM)的初步研究

本文研究了1986—1989年间BALB/C小鼠发生的两次散发流行和一次有BALB/C及NIH鼠群暴发流行的EDIM(Epizootic diarrhea of infant mice)。经过电镜、PAGE、实验感染、“ABC”组化抗原定位等证实病原为MRV,而且病毒大小、RNA电泳型与国外报道的MRV有差异。观察了本繁育场内7个品系小鼠,均查出有MRV抗体,但发病只见于BALB/C和NIH鼠群。不同鼠龄和胎次发病率亦有差异。还观察了病变组织的病理组织学,扫描电镜和超微结构的改变。     

我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究

对我国轮状病毒流行株NSP4基因变异特点的分析表明,NSP4基因主要可分为Wa组和Kun组,在Wa组内可形成三个亚组,形成了4种NSP4基因型。为了进一步阐明人轮状病毒流行株NSP4基因变异与其致病性变化是否存在联系,我们首先利用杆状病毒载体对NSP4蛋白进行表达,获得了对应4种不同NSP4基因型的重组杆状病毒rvBac97B6,rvBac97S34,rvBac97S36和rvBac97SZ8。用这些病毒感染Sf9细胞后,检测细胞内Ca2 浓度的变化,发现与野生型杆状病毒感染细胞相比,重组病毒感染细胞内的Ca2 浓度显著升高,但各个重组病毒之间无显著性差异。在此基础上,我们进一步在E.coli中分别表达纯化了代表Wa和Kun基因分组的97S34和97SZ8流行株的NSP4。分别用纯化的重组NSP4蛋白攻击乳鼠后,发现不同基因型的NSP4蛋白的致腹泻活性没有明显差异,这种作用可被NSP4抗体拮抗,但这种拮抗作用存在基因型特异性。上述结果表明人轮状病毒流行株NSP4氨基酸序列间的变异并没有使其钙调节及致腹泻能力产生改变,在致腹泻作用中发挥关键作用(或决定性作用)的氨基酸位点在不同NSP4基因型间可能是相对保守的。针对NSP4抗体的有效性也为新型轮状病毒疫苗和药物研究提供了线索。