多顺反子慢病毒载体介导编码基因在人胚胎干细胞中的表达

人胚胎干细胞的基因修饰对于干细胞在体外的调控及促进干细胞在治疗方面的应用具有很高价值.探讨了以艾滋病病毒-1为基础的慢病毒栽体转导人胚胎干细胞,表达2种或3种转移基因的可行性和功效.应用脑心肌炎病毒的内部核糖体进入住点(IRFS)序列和/或口蹄疫病毒(FMDV)裂解因子2A构建双顺反子和三顺反子慢病毒载体,绿色荧光蛋白(eGFP)和O<'6>-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶作为检测基因.抗嘌呤基因(嘌呤-N-甲基转移酶;PAC)作为选择基因,转染人胚胎干细胞后经过嘌呤选择.通过流式细胞技术和蛋白印迹杂交方法检测eGFP和MGMT的表达.多基因慢病毒载体可以同时将2或3个基因转移到人胚胎干细胞.多顺反子慢病毒栽体转导人胚胎干细胞后经过嘌呤选择,可以使转移基因高效、均匀的表达,在人胚胎干细胞的基础和应用研究方面具有重要意义.     

HPV16 E6通过阻碍ING4对p53作用而抑制细胞凋亡的实验研究

通过HPV16 E6干扰ING4对p53作用的实验研究,探讨HPV16 E6新的致癌机制。采用转染及免疫共沉淀实验证明HPV16 E6阻碍ING4和p53结合及其诱导的p53蛋白乙酰化的作用;将表达p53、ING4和p53报告基因与HPV16 E6或其突变体的质粒共转染p53蛋白阴性的SaoS2细胞系,荧光素酶报告基因检测HPV16 E6抑制ING4对p53基因在转录水平的影响;并采用细胞集落形成实验检测HPV16 E6对ING4所诱导p53途径所致细胞凋亡的抑制。HPV16 E6阻碍ING4和p53结合及其诱导的p53蛋白Lys-382的乙酰化;HPV16 E6减弱ING4在转录水平对p53基因的调控,HPV16 E6抑制ING4诱导的p53途径介导的细胞凋亡,且所有这些作用不依赖p53蛋白的降解。HPV16 E6阻碍ING4对p53的作用而抑制细胞凋亡可能是其引起癌变的途径之一。     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶( hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT )的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关．制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究．构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%．RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低．最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著．说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件．