利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

目的 为了获得白化的C57BL/6N小鼠,扩大其在皮肤移植和胚胎干细胞方面研究中的应用。方法 通过体外设计合成Cas9 mRNA和系列sgRNA(single guide RNAs),注射到小鼠的受精卵内,破坏合成C57BL/6N小鼠黑色素生成必须的酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因序列的第1和第2外显子,产生基因突变,获得F0代白化的C57BL/6N小鼠,然后经过重复回交和自交,形成白化C57BL/6N小鼠近交系。结果 经过注射两对sgRNA,成功的获得了F0代的白化小鼠,在Tyr基因的第1和第2外显子中均发生了缺失突变,小鼠可以将突变基因传递给后代,并在其后代中产生了纯合的白色C57BL/6N小鼠,最后对白化小鼠突变类型进行了分析。结论 通过CRISPR-Cas9技术破坏了小鼠Tyr基因,成功地建立了白化C57BL/6N小鼠近交系,为将来的嵌合体制作、组织移植提供了新的研究工具。     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRTmRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.     

成体兔转基因成纤维细胞的克隆分离及其核移植研究

哺乳动物体细胞核移植及其与转基因技术的结合为转基因动物的研究提供了新的思路和方法．然而,单个转基因细胞克隆的分离培养一直比较困难,很大程度上限制了转基因动物的研制．将pRNAT-U6.1/Neo质粒转染成体兔成纤维细胞,通过24孔细胞培养板分离培养法获得来源于单个转基因成纤维细胞克隆．由于单个成纤维细胞克隆在新鲜DMEM培养液中生长比较困难或缓慢,采用由DMEM/F12制备的条件性培养液进行筛选．以转基因成纤维细胞为供体细胞进行核移植,囊胚率为23.5%,与来源于成体兔正常成纤维细胞相比较差异不显著．并且利用PCR或多重PCR方法鉴定筛选的转基因细胞克隆及其核移植胚胎中整合的Neo^R基因和常染色体β-actin DNA．为转基因哺乳动物细胞的分离培养和核移植胚胎的鉴定提供可靠的方法,缩短了转基因动物的研制周期,降低生产成本,同时为进一步通过核移植技术获得转基因克隆兔提供了条件     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶( hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT )的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关．制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究．构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%．RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低．最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著．说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件．