Gallinacin-2在毕赤酵母中的分泌表达

利用RT-PCR技术,从鸡肺脏总RNA中克隆了Gal-2 cDNA全序列,以克隆载体为模板PCR扩增Gal-2成熟肽cDNA,将成熟肽cDNA插入到分泌型表达载体pPIC9k中,构建pPIC9k-Gal-2成熟肽表达载体;通过电转化方法将表达质粒导入到毕赤酵母GS115体内,阳性克隆菌经甲醇诱导表达,SDS-PAGE蛋白电泳检测在3.9ku附近出现预期大小的条带,灰度扫描显示蛋白表达量占总分泌蛋白量的63.7%。抑菌试验结果表明,表达的防御素对大肠埃希氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌活性。     

内毒素诱发鸡多脏器损伤及其对肝TLR4 mRNA表达影响

选取20日龄肉仔鸡随机分为四组,实验组A（灌服LPS100EU／Kg）、B（灌服LPS200EU／Kg）、C（灌服LPS300EU／Kg）和对照组D（灌服生理盐水）。检测不同剂量的LPS在不同时间对鸡多脏器损伤以及内毒素识别因子肝脏Toll样受体4mRNA表达的影响,为进一步揭示禽内毒素血症的发病机理提供依据。实验表明：12～24h是LPS诱发多脏器损伤并引起TLR4表达异常的敏感期,12h肝组织TLR4mRNA的表达水平降至最低,24h后开始回升且随着LPS攻毒剂量的增加,TLR4表达水平回升的速度递减,至48h仍无法达到正常表达水平,这可能与肝细胞作为腺上皮细胞参与TLR4表达调节或机体对抗过度炎症反应而产生的一种保护性反馈引起。     

毒力基因ompA在禽致病性大肠埃希菌外膜囊泡诱导鸡气管黏膜上皮细胞凋亡中的功能

【目的】探究毒力基因ompA在禽致病性大肠埃希菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)分泌外膜囊泡(outer membrane vesicle,OMV)诱导鸡气管黏膜上皮细胞(chicken trachea epithelium cells, CTECs)凋亡中的功能,为后期深入研究APEC-OMV的致病机制奠定基础。【方法】以APEC分离株AE17为野生株,利用CRISPR/Cas9系统构建ompA基因缺失株,利用表达载体pET-28a构建ompA基因过表达株,并分别提取野生株、缺失株、pET-28a空载株及过表达株的OMV。通过透射电镜、纳米颗粒分析、annexin V-FITC/PI双染检测及超微病理切片等实验探究毒力基因ompA在APEC-OMV诱导CTECs细胞凋亡中的功能。【结果】成功构建缺失株AE17ΔompA、空载株AE17-pET-28a及过表达株AE17-pET-28a-OmpA。与AE17的OMV(AE17-OMV)相比,AE17ΔompA的OMV(AE17ΔompA-OMV)颗粒浓度显著减少且平均粒径显著降低(P<...     

大肠杆菌三型分泌系统2转录调节子EtrA对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,大肠杆菌三型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)可通过转录调节子调控其致病性,但在APEC中转录调节子EtrA对其致病性的影响目前尚不清楚。【目的】研究ETT2中转录调节子EtrA对APEC致病性的影响。【方法】利用Red同源重组技术构建ETT2-etrA基因缺失株及回复株。比较生长性能、生物被膜形成、运动性及对血清敏感性的差异,基于RNA-Seq测序及Real-timePCR技术比较野生株和缺失株中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平。【结果】与野生株相比,缺失株及回复株生长特性无显著变化(P0.05),但APEC40-ΔetrA生物被膜形成能力和对血清敏感性明显增强(P0.001),运动性较野生株明显下降(P0.01),回复株的表型有所回复。转录组学筛选出7个毒力差异基因,生物被膜形成相关基因显著上调,参与影响细菌运动性的基因显著下调。qRT-PCR验证与转录组学结果一致。【结论】etrA缺失可以显著影响APEC的生物被膜形成、运动性及对血清的敏感性,这可为进一步探讨ETT2对APEC的致病作用提供参考。     

毒力基因yqeH功能分析及对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽类急性或亚急性感染,在近年新发现的大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)中,毒力基因yqeH对其致病性的影响尚不明确。【目的】探究yqeH在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yqeH缺失株ΔyqeH及其回复株CΔyqeH,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yqeH对APEC生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验、致病力测定及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平,探究yqeH对APEC感染宿主的影响。【结果】构建了缺失株ΔyqeH和回复株CΔyqeH;生物学特性试验结果表明,与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH生物被膜形成能力、运动能力降低,对酸、碱、渗透压、氧化休克的耐受力降低,抗血清杀菌能力及致病力显著降低;与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH对鸡气管黏膜上皮细胞的黏附及侵袭能...