盐碱土壤转Bt基因棉花外源蛋白表达量时空变化及对抗虫性的影响

盐碱地是潜在的可利用耕地资源,但土壤盐碱化严重制约了农业生产的可持续发展。基于棉花机械化程度低、劳动力成本和生产资料投入剧增、比较效益下降和实施粮食生产安全战略等因素影响,我国长江流域和黄河流域棉花面积锐减,种植区域向内陆盐碱旱地或滨海盐碱地转移,但目前针对盐碱地转Bt基因棉种植可能带来的生态安全性问题研究甚少,正成为国内外研究的焦点和热点。伴随着棉花向盐碱地大面积转移种植趋势,检测盐胁迫是否影响转基因抗虫棉抗虫性,明确其影响程度,直接关系到转基因抗虫棉种植的安全性,也是目前抗虫棉扩大生产中迫切需要解决的问题。以非转基因棉花为对照,分别在低盐、中盐和高盐土壤种植的棉花的苗期、蕾期和花铃期采样,室内测定了转Bt基因棉花叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率和外源蛋白表达量。研究结果发现盐分胁迫下转Bt基因棉花苗期叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率下降了9.22%—47.46%,蕾期下降了31.61%—45.42%,花铃期下降了3.59%—18.52%;土壤盐分显著降低了转Bt基因棉花叶片中外源蛋白的表达量,苗期功能叶外源蛋白表达量下降了7.66%—29.86%;蕾期下降了3.77%—36.85%;花铃期下降了18.13%—41.02%;相关性分析表明,盐分胁迫条件下转Bt基因棉花叶片中外源蛋白表达量与其对棉铃虫抗性程度存在正相关关系。结果表明,盐碱土壤显著降低了转Bt基因棉花叶片外源杀虫蛋白表达量,从而导致转Bt基因棉花叶片对棉铃虫的抗虫性下降。研究土壤盐分对转Bt基因棉花对棉铃虫的影响及其作用机制,可为建立盐碱地转Bt基因棉花田害虫综合防控技术体系、转Bt基因棉花环境安全评价及转Bt基因棉安全管理提供依据。     

转GAFP基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响

新型转基因棉花生态适合度及其对棉田昆虫群落的影响是转基因棉花环境安全评价的重点内容.本文选用新型转GAFP(Gastrodia anti-fungal protein)基因棉花及其非转基因亲本棉花为试验材料,于2013和2014年在河南安阳研究了田间棉花生态适合度及其对昆虫群落的影响.结果表明: 转基因棉蕾期、花铃期和铃期叶片干物质量与其亲本无显著差异;苗期比叶面积显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期叶面积显著大于亲本;苗期株高显著低于亲本,蕾期、花铃期和铃期株高与亲本无显著差异;棉花生长的4个关键时期(苗期、蕾期、花铃期和铃期),转基因棉单株果枝数、蕾数和脱落数均与亲本无显著差异,而铃期单株大铃数显著低于亲本.棉铃虫发生的3个高峰期,转基因棉对棉铃虫和甜菜夜蛾无明显控制作用,且对棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的昆虫个体总数、昆虫群落结构与组成、均匀性指数、多样性指数和优势集中性指数均无显著影响.表明外源基因GAFP导入后,新型转基因棉花营养生长增强,产量构成性状整体无显著变化,未引起棉田昆虫群落变化.研究初步明确了新型转基因棉花生存竞争势态和棉田昆虫群落发生规律与动态,可为新型转基因棉花环境安全评价提供理论依据,同时为转基因棉花环境安全评价积累科学数据.     

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花转Cry1Ac基因棉花非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田转Cry1Ac基因棉田非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。     

Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的安全性研究

【目的】转基因作物对非靶标昆虫的影响是转基因作物环境安全评价的重要内容,研究Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的影响,对转基因作物的环境安全评价具有重要意义。【方法】采用实验动物学、分子生物学等方法,研究Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫发育历期、成虫体重、雌雄比例及体内氨基酸种类和含量的影响。【结果】与蔗糖对照组相比,Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫不同龄期的发育历期、成虫体重和雌雄比例均无明显差异,对体内氨基酸种类和含量也没有显著差异。【结论】Cry2Ab蛋白对龟纹瓢虫的生长发育及代谢无显著影响。     

转ACO2基因优质棉生长特性及其对田间昆虫群落的影响

新型转基因棉花的生长特性及其对棉田昆虫群落的影响是转基因棉花环境安全评价的重点内容,也是转基因棉花环境安全评价过程必须评价的内容。选用新型转ACO2基因棉花及其亲本中棉所24为试验材料,于2013年和2014年在河南安阳进行了田间棉花生长势及其对昆虫群落影响的试验。在棉花苗期、蕾期、花铃期和铃期,转基因棉花叶片干重与其亲本均无显著差异,苗期、蕾期叶面积和比叶面积与亲本无显著差异,花铃期、铃期叶面积与比叶面积均显著高于亲本材料,其中2013年分别比对照高27.1%和26.2%,2014年分别高16.0%和19.9%,差异均达显著水平;株高、主茎叶片数、大铃数、小铃数和蕾铃脱落数均与亲本材料相当,但铃期果枝数显著高于亲本材料;3个棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)发生高峰期,转优质基因棉花对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫校正死亡率与亲本对照材料无显著差异;昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落昆虫个体总数均显著高于亲本棉田,两年分别比对照高11.5%、10.5%、33.4%和12.0%、8.1%、63.1%,其中2013年差异达显著水平,2014年由于昆虫发生程度总体较轻,差异不显著,但所属"目"、"科"、"种’、生物多样性指数、优势种昆虫及其优势度与其亲本棉田无显著差异,表明外源基因ACO2导入后,对棉田昆虫发生及其群落结构没有影响,棉花生长势无明显优势,但产量构成性状在部分时期增强。上述研究初步明确了新型转基因棉花生存竞争势态和棉田昆虫群落发生规律与动态,可为新型转基因棉花环境安全评价提供理论依据,同时为转基因棉花环境安全评价积累科学数据。     

5个棉蚜组织蛋白酶B基因克隆及在不同寄主专化型中的表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢中发挥着重要作用。本研究从棉蚜Aphis gossypii Glover的转录组数据库中挑选Cath B并克隆得到全长cDNA序列,使用qRT-PCR分析这些基因在不同寄主专化型棉蚜不同龄期中的相对表达量。通过分析棉蚜体内5个高表达组织蛋白酶B基因不同发育阶段的表达谱,比较了不同专化型棉蚜在寄主转换之后的表达差异。研究发现,这5个基因在不同龄期不同寄主上均表达。棉花型棉蚜在棉花寄主上不同基因间的表达各不相同。黄瓜型棉蚜在黄瓜Cucumis sativus L.上AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3基因均在成蚜时期表达量相对较高,AgCb-4、AgCb-5基因表达量则与之相反。分别将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜转接到西葫芦Cucurbita pepo L.上后,棉花型棉蚜AgCb-1、AgCb-4基因和黄瓜型棉蚜AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3基因均在成蚜不同时期的表达量显著大于转接前。结果表明：AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3、AgCb-4、AgCb-5基因表达量伴随着棉蚜的生长发育以及寄主的转换,表现出不同的差异。说明组织蛋白酶在棉蚜对寄主植物的适应性过程中可能发挥作用。     

基于线粒体COⅠ基因黑唇苜蓿盲蝽种群遗传结构与遗传多样性分析

【目的】黑唇苜蓿盲蝽Adelphocoris nigritylus Hsiao作为一种植食性昆虫,近年来越来越多的个体有转向农作物取食危害的趋势。本研究旨在探讨黑唇苜蓿盲蝽在中国北部地区的种群遗传结构、遗传多样性、系统发育和种群历史动态。【方法】针对10个地理种群256头个体线粒体COⅠ基因片段(893bp)进行种群遗传分析。【结果】共检测到33个单倍型,确定1个祖先单倍型H5和3个高频率单倍型。Mantel检测显示种群间遗传距离与地理距离没有显著的相关性。中性检验和Beast分析显示种群整体经历了扩张。AMOVA和种群间成对Fst分析表明种群间遗传差异整体较低。Migrate分析显示种群间存在大量的基因流。BI单倍型系统发育树和Network网络中介图分析显示种群在整体扩张的同时,部分种群个体已经出现了遗传分化并形成独立的遗传支系,虽然各种群遗传单系还没有形成。【结论】作者推测人为干扰可能是导致黑唇苜蓿盲蝽整体扩张的主要原因;种群间高水平的基因流是导致低遗传差异的重要原因;廊坊种群与其它种群间存在显著的遗传差异和低的遗传多样性,可能是由于该种群在扩张过程中发生了遗传漂变。     

2009-2013年Bt棉田节肢动物群落多样性动态变化

研究多年种植转Bt基因棉花对棉田节肢动物群落昆虫结构与组成、生物多样性的影响,明确其变化趋势,可为棉田害虫综合治理与生态调控、转Bt基因棉花环境安全性评价提供科学借鉴。于2009-2013年连续5年对转Bt基因棉花中棉所41和非转基因棉花中棉所49棉田节肢动物群落进行了系统调查,并结合5a气象因子的变化,分析了5年内棉田节肢动物群落相关参数的变化趋势。结果分析表明,2009-2013年中棉所41棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落所属目数有所上升,但差异不显著;所属科数、物种数、个体总数均呈现先上升后下降的趋势,个别年份差异显著,其余年份基本保持不显著的波动水平;昆虫群落和害虫亚群落多样性指数呈下降的趋势,至2013年下降达到显著水平,其余年份之间差异不显著,天敌亚群落多样性指数无显著变化;昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落均匀性指数无显著变化;昆虫群落和害虫亚群落优势集中性指数有所上升,至2013年差异达到显著水平,天敌亚群落优势集中性各年份间无显著变化;与中棉所49棉田相比,相同年份中棉所41棉田昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落结构与组成、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数均无显著差异。可见,短期内非剧烈天气变化对转基因棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落在结构与组成、生物多样性方面没有明显的影响。     

Cry1C蛋白对4种棉花害虫的致死效果

【背景】苏云金芽胞杆菌(Bt)属革兰氏阳性细菌,是目前世界上应用最广泛的杀虫剂。来自Bt的Cry1Ac基因自1997年商业化以来,其产生的蛋白对棉铃虫、红铃虫等鳞翅目害虫起到了很好的控制作用。但该基因对甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟等害虫的控制作用较差,因此,需要寻找新的Bt基因亚型控制上述害虫。【方法】将Cry1C蛋白加到人工饲料上形成药膜后,接入低龄幼虫进行生物测定,以常规不加毒蛋白的饲料为对照,计算1、3、5、7 d后不同害虫的校正死亡率。【结果】随着Cry1C蛋白浓度的增加及时间的延长,甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率逐渐升高,Cry1C浓度为10μg·m L-1时,处理7 d后,甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的校正死亡率分别为100%和85.42%,表明甜菜夜蛾比斜纹夜蛾更敏感,而棉铃虫和玉米螟对Cry1C蛋白的敏感性较差。【结论与意义】Cry1C基因可作为控制棉田甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的有价值的候选基因,但是对棉铃虫和玉米螟无效。该研究为筛选新的Bt基因亚型用于防治不同的棉花害虫提供了数据参考。     

棉蚜唾液蛋白C002基因克隆及在棉蚜不同寄主专化型中的表达分析

C002是蚜虫取食过程中的一种十分重要的水溶性唾液蛋白。本研究从棉蚜的转录组数据中,克隆得到棉蚜C002基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:AHX71991.1)。C002基因的开放阅读框全长为641 bp,编码213个氨基酸,推测其蛋白质的分子质量为24.1 k Da,等电点为9.06,具有由24个氨基酸组成的信号肽。运用荧光定量PCR技术,分析棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的时间表达谱,结果表明,C002基因在两种寄主专化型棉蚜生长发育的早期阶段表达量均较高。将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜分别转接到西葫芦后,C002基因的表达量在转接前后无显著变化,说明C002基因在棉蚜适应寄主过程中并没有起到关键性作用。