家蚕3-磷酸甘油脱氢酶基因BmGpd的结构特征与表达谱分析

3-磷酸甘油脱氢酶（GPDH）是真核细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性酶,具有能量传递等重要功能。家蚕Bombyx mori是重要的变态和能量代谢研究模式动物,为了明确GPDH在家蚕中的作用,本研究根据果蝇lethal （2） k05713的蛋白质序列,从家蚕C108品种克隆了2个完整的mRNA转录体,长度分别为3 456 bp和2 979 bp（GenBank登录号为GQ865685和GQ865686）,具有相同的2 166 bp ORF,编码721个氨基酸。克隆拼接了548 bp的第9内含子后,参照大造品种的全基因组数据,推测出BmGpd基因全长27 983 bp（GenBank登录号为EF154335）,包含16个外显子和15个内含子。编码蛋白具跨膜螺旋结构,pI为8.22,分子量为80.5 kD,1~20 氨基酸区域为信号肽序列。分子同源进化和蛋白质基序分析表明,BmGPD是家蚕中一种新GPDH成员,能在大肠杆菌Escherichia coli中诱导大量表达。RT-PCR分析表明,BmGpd基因表达量在5龄中期最高,在3 d的蛹中明显下调,进入滞育时表达量更低;血液中较低,中肠、丝腺、生殖腺和脂肪体中有大量表达。芯片表达谱显示,5龄第3天幼虫头和体壁中表达丰度最高,脂肪体和马氏管中最低,性别差异不显著。EST表达谱显示,4龄第2天中肠中表达丰度最高。RNAi结果显示,家蚕体内存在BmGpd基因产物代谢补偿途径。本研究为深入研究家蚕GPDH的表达调控以及与变态和能量代谢的关系创造了条件。     

摄入异烟肼对家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原循环和谷胱甘肽S-转移酶活性的影响

为了建立家蚕Bombyx mori的药物筛选和毒性评价模型, 以剂量为2 000 mg/kg的抗结核模药异烟肼饲喂家蚕5龄第3天幼虫后检测其中肠和脂肪体的抗氧化解毒相关代谢的变化。结果表明： 雌蚕中肠组织中, 总谷胱甘肽(GSH+2GSSG)、 还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)含量均呈现迅速上升再缓慢下降趋势; 谷胱甘肽S 转移酶(glutathione S-transferase, GST)活性升高到较大值后逐渐降低; GSH/GSSG的比值下降表明, 在72 min后中肠组织向氧化态转移。脂肪体组织中, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量变化均呈现迅速下降再迅速上升的趋势; GST活性达到最大值后逐渐降低后趋于平稳; GSH/GSSG比值升高表明, 在72 min后脂肪体组织向还原态转移。无论雌蚕还是雄蚕, 总谷胱甘肽、 GSH和GSSG含量以及GST活性均是脂肪体高于中肠。雌蚕的总谷胱甘肽含量、 GSH和GSSG含量高于雄蚕, 但雄蚕的GST活性高于雌性。结果说明, 摄入异烟肼引起了家蚕幼虫体内谷胱甘肽氧化还原状态的改变和酶活性的变化, 在这个过程中脂肪体起主要解毒代谢作用。     

野桑蚕性信息素结合蛋白基因pbp1、气味受体基因or1和or3的克隆及其与家蚕同源基因的进化分析

昆虫能够特异性识别同类异性。雄蚕蛾对雌蚕蛾感知定位过程中, 性信息素结合蛋白PBP1、气味受体OR1和OR3起重要作用。为研究家蚕Bombyx mori和野桑蚕Bombyx mandarina杂交困难的分子机制, 了解性识别相关基因的进化, 本研究克隆得到了野桑蚕的性信息素结合蛋白基因pbp1（GenBank注册号：GQ246497）和气味受体基因or1（Genank注册号：GQ246496）和or3（GenBank注册号：GQ246498）。序列分析发现, 家蚕与野桑蚕相比, pbp1基因存在4个SNP位点, 分别为C10A, A40T, T270C和A333G, 其中2个SNP位点引起氨基酸的改变, 分别为Q→K和N→Y; or1基因存在5个SNP位点, 分别为T910C, A1147C, A1192T, T1276C和G1282A, 其中1个SNP位点引起氨基酸F→L的改变; or3基因存在4个SNP位点, 分别为A507G, A513G, T605C和G672A, 其中1个SNP位点引起氨基酸I→T的改变。3个基因的遗传距离很近, 进化速率也很慢。氨基酸的分子量和等电点有细微差异或无差异。PHD预测的二级结构表明, 变异位点对附近区域的结构没有任何影响, 功能位点也没有变化。推测家蚕与野桑蚕之间, 这些基因功能可能没有差异, 即二者的雌雄性个体间可以相互感知、识别, 这与实验观察结果一致。     

糖蛋白的结构与功能

糖蛋白是由寡糖和多肽链共价修饰连接而形成的一类重要生理活性物质,它广泛存在于细胞膜,细胞间质,血浆以及粘液中,糖蛋白中的糖链在维持蛋白质稳定,抵抗蛋白酶水解,防止抗体识别及参与肽链在内质网的拆叠启动等方面发挥着重要作用,具有开关和调谐功能,激素功能,胞内转运功能,保护和促进物质吸收,参与血液凝固与细胞识别等,对于增殖的调控,受精,发生,分化以及免疫等生命现象,起着十分重要的作用。     

家蚕滞育性卵盐酸处理的靶物质

酯酶A4（EA4）是家蚕卵的滞育生物钟蛋白质。从家蚕C108品种产下后48 h的滞育性卵和盐酸活化处理卵分离纯化出EA4酶蛋白,使用合成的EA4活性多肽抑制因子PIN（氨基酸结构：SIFMTKQHSQ DDIIQHPLDY VEQQIHQQKQ KLQKQTLN）,研究了PIN对EA4酶蛋白的作用机制。滞育性卵的EA4酶蛋白和PIN在25℃混合24h后,用矩阵辅助激光解吸离子质谱法,检测到了二者的结合体,该结合体在盐酸处理后消失;盐酸活化处理蚕卵的EA4酶蛋白和合成PIN之间没有出现这种结合体。体外25℃,滞育性蚕卵EA4的ATPase特征性活性峰在6.5 h后出现,而盐酸活化处理蚕卵的EA4在1.5 h后出现活性峰值。盐酸处理可能通过解除PIN对EA4的抑制作用,在短时间内激活EA4酶蛋白,从而活化滞育性蚕卵。     

家蚕ABP与ABPX基因定位与表达分析

气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）在昆虫与外界环境化学信息交流过程中起着重要作用, 对昆虫的觅食、 求偶、 繁殖具有重要意义。触角结合蛋白（antennal binding protein, ABP）是OBP家族中的重要成员之一。为进一步探明家蚕Bombyx mori ABP与ABPX基因的结构、 表达及功能, 本研究利用染色体定位、 基因分析及半定量表达分析方法对其进行了研究。染色体定位分析表明, BmABP和BmABPX分别位于家蚕第5和第26染色体上, 基因结构差异较大, 可能功能上有较大差异。对家蚕胚胎、 幼虫和成虫不同发育阶段的雌、 雄虫多种组织进行基因表达谱分析发现, BmABP在家蚕发育的各个虫态、 多种组织器官中都有较高表达, 无时间特异性和组织特异性; BmABPX在不同发育时期和不同组织间差异显著（P<0.05）, 相对表达量以触角中最高, 其他非嗅觉组织中也多有表达, 性别间差异不大。结果提示, BmABP和BmABPX除了具有嗅觉相关功能外, 很可能还具有其他未知的生理功能。